動脈粥樣硬化對小鼠主動脈力學信號分子FAK的影響

張卓然 王剛 吳桂霞 馬明釗 李明軒 李靜

(新疆醫科大學 1基礎醫學院，新疆 烏魯木齊 830011；2第一臨床醫學院；3新疆生產建設兵團第六師奇臺醫院放射科)

隨著我國疾病譜的改變，動脈粥樣硬化(AS)引起的多種重要臟器缺血性疾病已成為不可忽視的公共衛生問題，其中僅缺血性心臟病2016年患病率就高達10.2‰〔1〕。AS病理過程起始自內皮損傷，除代謝因素外，血流機械應力是目前備受關注的導致血管內皮受損的重要因素之一。研究發現，高血流剪切應力(>15 dyne/cm2)具有促AS保護基因表達的作用，而AS常發部位多為低剪切應力(<4 dyne/cm2)，提示血流剪切應力與AS的發生密切相關〔2〕。許多研究顯示，黏著斑為血流機械應力致內皮損傷這一過程中將力學信號傳遞至胞內相應受體的重要機械感受器之一。

血流剪切應力轉導的核心是細胞與細胞外基質(ECM)之間的信息交互，由整合素、ECM成分、細胞骨架成分構成的大型細胞基底面復合物——黏著斑承擔著聯系細胞與ECM的橋梁作用，但整合素自身不能實現激酶功能，需依賴黏著斑激酶(FAK)發揮作用。FAK是黏著斑復合體合成與分解的關鍵媒介，黏著斑代謝及相關分子機制在AS這一病理過程中的研究仍較為欠缺。本研究以FAK為著眼點，利用ApoE-/-小鼠構建AS疾病模型，測定FAK及其活性形式磷酸化(P)-FAK在AS小鼠病灶組織中的表達水平，并分析其與小鼠血脂四項的相關性，以探討黏著斑中FAK的活化水平對AS發生發展的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑 C57BL/6J小鼠及ApoE-/-小鼠(華阜康生物技術公司，北京)。一抗FAK及P-FAK抗體(Tyr397)(圣克魯斯生物技術公司，美國)；二抗羊抗兔FITC-IgG(博奧森生物技術公司，北京)；山羊血清及含DAPI抗熒光淬滅封片液(碧云天生物科技公司，上海)。

1.2小鼠分組及疾病模型的建立 10只ApoE-/-小鼠為實驗組、10只C57BL/6J小鼠為對照，常規方法建立AS疾病模型，建模時間為8 w，每周定時測量體重，8 w后處死，取血送檢血脂四項：總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白脂固醇(LDL-C)，分離主動脈弓與主動脈根部標本固定包埋后進行病理鑒定，同時制作冰凍切片。

1.3免疫熒光檢測FAK、P-FAK(Tyr397)表達 冰凍切片復溫30 min，4%多聚甲醛固定15 min；10%山羊血清封閉30 min；加一抗稀釋液：一抗1∶400+1.5%山羊血清+磷酸鹽緩沖液(PBS)，-4℃冰箱孵育過夜；復溫1 h；FITC標記IgG染色：二抗1∶400+1.5%山羊血清+PBS，孵育2 h；封片干燥；熒光倒置顯微鏡下攝像采集圖片。

1.4統計學方法 Image pro plus6.0采集FAK、P-FAK特異性熒光部位平均灰度值，作為其表達含量指標；采用SPSS22.0軟件進行獨立樣本t檢驗及Pearson相關性分析。

2 結 果

2.1AS疾病模型鑒定 實驗組AS血脂四項均較對照組明顯增加(P<0.05)，見表1。小鼠主動脈切片HE染色病理鑒定結果顯示，各切片主動脈結構完整，層次可辨，提示AS建模成功，標本保存完好，見圖1。

表1 兩組血清脂質水平比較

2.2FAK與P-FAK表達水平檢測及P-FAK與血脂四項相關性分析 免疫熒光結果顯示，實驗組AS斑塊中FAK與P-FAK呈綠色熒光，DAPI染核呈藍色，FAK、P-FAK多表達于血管內膜、中膜層及胞質，見圖2。實驗組AS小鼠病灶P-FAK表達水平(0.40±0.038)顯著高于對照組(0.35±0.030；P<0.05)，而FAK表達水平(0.78±0.042)與對照組(0.82±0.052)無統計學差異(P>0.05)。Pearson相關性分析顯示，P-FAK表達水平與小鼠血脂、TC、LDL-C、HDL-C、TG具有顯著相關性(r=0.84、0.87、0.89、0.71，均P<0.05)。

圖1 各組FAK主動脈病理鑒定(HE染色)

圖2 兩組主動脈組織FAK、p-FAK免疫熒光染色(×400)

3 討 論

隨著對AS不斷地深入研究，目前發現血流機械力作用與AS的發生發展緊密聯系，有研究證實時間平均壁面剪切力(TAWSS)和振蕩剪切指數(OSI)可以作為AS的主要危險參數〔3〕，通過聯合血流動力學和血脂等生化指標可較為準確地預測AS發生的風險部位〔4〕。AS相關的血流機械力包括軸向斑塊應力(APS)、內皮切應力(ESS)和斑塊結構應力(PSS)等〔5〕。各類血流機械力信號經常見于內皮細胞膜機械感受器，如整合素家族、黏著斑(FA)、細胞膜糖萼〔6〕、機械門控Piezo離子通道(Piezo)1〔7〕和跨膜受體蛋白(NOTCH)1〔8〕機械門控離子通道、G蛋白耦聯受體等發揮作用，并通過與F-actin、微管中間絲等細胞骨架蛋白連接，由Hippo、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和核轉錄因子(NF)-κB等〔9,10〕信號通路參與實現生物學效應。

血流應力參與AS發生過程中，細胞黏附的改變為關鍵環節，黏著斑是使細胞與ECM緊密黏附并相互作用的重要結構之一，有研究表明，根據黏著斑平均尺寸可以準確而穩定地預測細胞遷移行為〔11〕。黏著斑類型眾多，組成成分復雜，其代謝方式、結構和功能至今尚未完全闡明，但其中心結構均為整合素家族分子。由于其本身并不具有激酶活性，FAK則為介導整合素信號轉導的核心蛋白。

FAK可以被分為3個功能區，即N端FERM、C端FAT和中央激酶結構域。在黏著斑構建過程中，連接于黏著斑的肌球蛋白受力后可激活FAK，但尚不清楚FAK是直接被機械信號激活還是被機械信號轉導后激活〔12〕。整合素尾端與活化態的FAK N端FERM結構域的F1區結合而消除自抑制狀態，實現活化。FAK C端的FAT結構域可與樁蛋白(paxillin)和(或)踝蛋白(talin)結合以維持黏著斑的完整。整合素與ECM結合后可以通過FAK的FAT結構域與paxillin連接進一步招募FAK和talin，從而增強整合素與ECM的連接〔13〕。另外，FAK還參與機械力傳感器p130Crk相關底物(p130Cas)的招募，并使其的底物結合位點構象改變從而將機械信號轉化為生物化學信號〔14〕。可見，黏著斑的合成與分解是一個高度動態化的復雜過程，順利完成這一過程的關鍵在于調節相關分子的自抑制狀態〔14〕，從而精確控制黏著斑組分的激活，從而完成相關蛋白的募集定位和復合物前體的形成。在這一過程中，FAK通過調節整合素的活化和內吞再循環對黏著斑的合成與分解起著關鍵作用〔15〕，是協調黏著斑各組分的關鍵激酶，在黏著斑信號網絡中起著重要作用。

因此，FAK協助整合素等黏著斑組分完成與細胞骨架的連接，并在黏著斑合成與分解過程中承擔不可或缺的角色，也使其成為指示血流機械應力因素對血管內皮細胞影響的重要指標。近年來，在各類脈管疾病中FAK作為細胞黏附與力學信號分子備受學者關注。研究發現，內源FAK抑制劑FRNK通過與FAK結合位點競爭性結合抑制 FAK 活性〔16〕，從而抑制AS中細胞的黏附遷移。在血管炎癥研究發現，FAK/Pyk2雙重抑制劑(PF-271)可在相關炎癥因子刺激下特異抑制血管細胞黏附分子(VCAM)-1的表達，有效降低巨噬細胞黏附及遷移的能力〔17〕。在一項實驗中發現，0.03%FAK 抑制劑對AS的發展有明顯的抑制作用，同時尚未顯示任何明顯的毒性作用〔18〕，這將為以FAK活性調節作為治療AS的潛在靶點提供了可能性。

本研究結果表明FAK的異常活化與AS進展相關；同時，提示P-FAK的異常表達可能與高LDL、高TC等風險因素協同促進AS的發生發展。

綜上，FAK在機械應力、炎癥反應、血脂代謝等內環境變化時產生異常活化表達，調控黏著斑的合成與分解，從而影響細胞的黏附、增殖、遷移等生物學行為。此外，眾多研究表明，在AS病變發生和發展過程中，FAK是不同血流條件下內皮細胞整合素下游的關鍵信號的傳導介質〔19〕，后續可能成為抑制機械應力傳導和血管炎癥反應等多個角度治療AS的潛在候選靶點之一。