siRNA介導MAGE-3沉默抗老年大鼠胃癌活性作用及相關機制

楊梅 皮國濤 高歡 柳英輝 陳文習

(鄂州市中心醫院消化內科，湖北 鄂州 436000)

胃癌是臨床中常見的一種癌癥，老年人是常發病人群，主要是由于老年患者對其臨床癥狀的變化不敏感，一旦發現時，大部分老年患者已經處于胃癌中晚期〔1,2〕。目前關于胃癌發病機制尚不明確，老年患者因為免疫能力降低，大部分患者手術后產生的并發癥較多，因此具有較高的病死率，研究指出，在老年胃癌患者中常采用新輔助化療配合免疫生物進行治療，能有效地提高患者生存時間〔3〕。RNA干擾是雙鏈RNA經過轉錄后導致基因沉默，研究顯示可以替代基因敲除，在腫瘤及病毒感染導致的疾病中被廣泛應用〔4〕。黑色素瘤抗原基因(MAGE)被稱為沉默腫瘤基因，在正常細胞中基本不見表達，在腫瘤細胞轉錄、翻譯中具有重要作用，參與腫瘤演進過程〔5〕。本研究探討siRNA介導MAGE-3沉默抗老年大鼠胃癌活性的作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1材料 選取30只清潔級SD雄性老年大鼠，22～24周齡，體重680～850 g，均由河北伊維沃生物科技有限公司提供，許可證號：YXK(冀)2019-008。均在室溫22℃、濕度50%環境下飼養，自由飲食和飲水。主要試劑和儀器：N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG，山東淄博張店東方化學股份有限公司)；蘇木素-伊紅(HE，上海吉瑪公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法試劑(中國碧云天生物技術研究所)；BglⅡ、HindⅢ內切酶(美國Fermentas公司)；酶標儀(上海博蘭生物科技有限公司)；端粒酶催化亞單位(hTERT)、信號轉導與激活因子(STAT)3、p53、血管內皮生長因子(VEGF)單克隆抗體(美國Amresco公司)；二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑(中國碧云天生物技術研究所)。

1.2方法

1.2.1胃癌模型建立 30只老年大鼠參考張丹等〔6〕文獻建立胃癌模型，具體操作：給予濃度為100 μg/ml MNNG飲用水(在使用前配制，避光保存)，連續干預4 w，之后大鼠出現直徑約為1 cm的腫塊視為胃癌模型建立成功，之后更換為飲用水，共建模成功27只，隨機分為模型組、對照組和MAGE-3沉默組各9只。

1.2.2MAGE-3基因沉默

1.2.2.1靶向MAGE-3基因寡核苷酸建立 嚴格按照siRNA片段設計原則完成，以GenBank中MAGE-3基因序列。通過設計軟件，確定997-1015(GCAGTGATCCTGCATGTFA)、464-482(GGACTCCAGCAACCAAGAA)，設計過程中BglⅡ、HindⅢ酶切殘端2對發卡樣DNA寡核苷酸均由金斯瑞生物科技有限公司完成。寡核苷酸各序列組成為：SiM11：5′-GATCCCCGGACTCCAGCAACCAAGAATT CAAGAGATTCTTGGTTGCTGGAGTCCTTTTTA-3′;SiM12:5′-GGGCCTGAGGTCGTTGGTTCTTAAGTTCT CTAAGAACCAACGACCTCAGGAAAAATTCGA-3′;SiM21:5′-GATCCCCGCAGTGATCCTGCATGTTATTC AAGAGATAACATGCAGGATCACTGCTTTTTTA-3′,SiM22:5′-GGGCGTCACTAGGACGTACAATAAGTTCT CTATTGTACGTCCTAGTGACGAAAAATTCGA-3′。

1.2.2.2寡核苷酸退火及pSUPERneoGFP連接 將提前合成的寡核苷酸SiM11、SiM12、SiM21、SiM22與50 μl H2O溶解，濃度為2 μg/μl；各取2 μl的SiM11、SiM12，加36 μl的退火緩沖液充分混合均勻，在95℃連續孵育4 min，70℃連續孵育10 min，緩慢冷卻至4℃。BglⅡ、HindⅢ酶切殘端2對發卡樣DNA寡核苷酸(pSUPERneoGFP)分別與退火完成后的對照序列，實驗序列重組，反應體系，分為對照組和MAGE-3沉默組。

1.2.3胃癌腫瘤生長狀況及病理學觀察 將大鼠處死后，剝離腫瘤，采用電子天平稱取大鼠腫瘤質量，計算腫瘤體積和抑瘤率。快速提取處死大鼠胃黏膜組織制作標本，將其置于4%的多聚甲醛中進行固定，制作常規石蠟切片，在濃度0.5% HE染色10 min，自來水沖洗1次；使用乙醇梯度進行脫水處理，最后用中性樹膠進行封片。

1.2.4胃癌細胞增殖情況 提取大鼠胃癌細胞接種在24孔板中，(5～10)×104/孔，加入1 000 μl的培養基。過夜培養后加50 μl的MTT，連續培養3～4 h，離心處理后，加500 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，對藍紫色結晶進行溶解，震蕩處理后加快其完全溶解，通過酶標儀在490 nm波長觀察吸光值。計算各組大鼠胃癌細胞增殖指數。

1.2.5hTERT、STAT3、p53、VEGF蛋白表達檢測 采用Western印跡檢測，將采集到的血液標本10 000 r/min離心處理10 min，對上清液進行提取后，二喹啉甲酸(BCA)進行蛋白定量檢測，在2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在100℃環境中加熱5 min有助于蛋白發生變性。凝膠電泳完、轉膜，取膜，4℃環境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時間為1 h，將一抗使用0.05%～0.10% TBST給予稀釋(hTERT、STAT3、p53、VEGF一抗為1∶1 000)，4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，5 min/次，二抗被0.05%～0.10% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動孵育時間為1 h，再次采用TBST連續洗膜3次，5 min/次。DAB顯色，定量分析蛋白表達情況。以GAPDH為內參。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0軟件行方差分析、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1各組胃癌腫瘤生長狀況比較 與模型組相比，對照組腫瘤質量、腫瘤體積升高，MAGE-3沉默組腫瘤質量、腫瘤體積下降，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比，MAGE-3沉默組腫瘤質量、腫瘤體積降低，抑瘤率〔(16.20±2.72)%vs (24.14±5.15)%〕增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2各組病理學觀察 模型組和對照組胃黏膜中腺體數量出現不同程度的減少，胃黏膜固有層逐漸變薄，黏膜下層伴有充血，水腫出現，淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤嚴重；MAGE-3沉默組胃黏膜厚度逐漸恢復正常，腺體排列整齊，但仍有商量的淋巴細胞浸潤。見圖1。

2.3各組胃癌細胞增殖情況及hTERT、STAT3、p53、VEGF蛋白表達比較 與模型組相比，對照組胃癌細胞增殖指數、hTERT、STAT3、p53、VEGF蛋白表達升高，MAGE-3沉默組胃癌細胞增殖指數、hTERT、STAT3、p53、VEGF蛋白表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比，MAGE-3沉默組胃癌細胞增殖指數、hTERT、STAT3、p53、VEGF蛋白表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 各組胃癌腫瘤生長狀況、胃癌細胞增殖指數hTERT、STAT3、p53、VEGF蛋白表達比較

圖1 各組病理學觀察(HE染色，×200)

圖2 各組hTERT、STAT3、p53、VEGF蛋白表達比較

3 討 論

臨床中胃癌患者發病特點是惡性程度高，患者具有較高的死亡率，因此導致胃癌治療難度增加。老年胃癌患者隨著年齡增加，各種器官的儲備功能逐漸降低，會伴隨多種基礎疾病發生〔7〕。目前臨床中多采用手術治療，但患者治療效果不顯著，采用化療會對患者正常細胞帶來損傷，降低免疫力〔8〕。

MAGE-3在黑色素瘤中廣泛存在，并且在多種腫瘤中均有表達，可以作為一種腫瘤特異性共享抗原〔9〕。相關研究顯示，在皮膚損傷愈合過程中，MAGE-1在正常新生皮膚組織中有過表達，因此推測MAGE不僅參與腫瘤發展，同時在組織細胞正常生長、分化中也有重要作用，可能參與炎癥及組織損傷修復過程〔10,11〕。

本研究結果表明，siRNA介導MAGE-3沉默能明顯抑制胃癌腫瘤生長，從而控制疾病發展。張國俊等〔12〕研究結果中也證實，RNA干擾介導MAGE3基因表達沉默能明顯降低肺癌獨立性生長能力，從而對肺癌細胞定植起到一定的抑制作用。

端粒酶被稱為逆轉錄酶，hTERT是一種被端粒酶催化的活性亞單位，其水平的高低受細胞端粒酶活性的影響，兩者之間呈正相關〔13〕，因此臨床中主要通過檢測hTERT來反應端粒酶的活性。研究顯示，端粒酶被激活后，端粒縮短停止，處于動態平衡，細胞因此具有無限增殖的能力，端粒酶激活、端粒長度，在細胞惡性病變中發揮著關鍵性的作用〔14,15〕。在胃黏膜細胞-胃癌前病變-胃癌這一過程中，端粒酶逐漸被激活，其活性水平逐漸升高，參與胃癌形成過程〔16〕。本研究結果說明，siRNA介導MAGE-3沉默能抑制端粒酶活性，有助于抑制胃癌惡性增殖，維持細胞穩定，從而能進一步維持胃癌細胞增殖、凋亡過程中的重要平衡。

STAT3在信號傳導、通路轉錄中可以作為一種激活因子，參與多種細胞生長、分化、凋亡過程，有研究認為，STAT3在胃癌組織中顯示高水平，在胃癌患者診斷及預后評估中發揮著關鍵性的作用，可以作為臨床中一種分子標志物，為胃癌治療提供新的研究方向〔17,18〕。p53蛋白表達水平較高及基因大鼠突變，均會促進腫瘤發展，可能在癌前病變各個階段發揮作用〔19〕。本文研究中siRNA介導MAGE-3沉默能通過下調STAT3、p53蛋白表達，抑制腫瘤生長，從而抑制腫瘤活性。VEGF對血管內皮細胞有絲分裂過程有一定的誘導作用，促進血管生成，增加血管通透性，參與血管生長過程〔20,21〕。

本研究結果證實，siRNA介導MAGE-3沉默能下調老年胃癌大鼠VEGF蛋白表達，從而抑制新生血管產生，對胃癌有一定的阻斷和逆轉作用，也是治療胃癌的重要作用機制。

綜上，siRNA介導MAGE-3沉默能抑制老年大鼠胃癌腫瘤生長，通過調控hTERT、STAT3、p53、VEGF蛋白表達，抑制胃癌活性。