LETM2基因在胃癌中的表達及其對胃癌腹膜轉移預測和預后的意義

施若云，王珺嵐，張真真

胃癌是全球最常見的5種癌癥之一，也是全球癌癥相關死亡的第三大原因，內鏡診治早期篩查可提高胃癌的治愈率，晚期胃癌患者易在根治性切除術后出現腹膜播散轉移，提示預后不良[1]。腹膜播散轉移是胃癌相關的死亡原因，且化療、腹腔內灌注或姑息手術的療效均有限[2]。此外，當腹水量少或轉移灶隱匿時，影像學檢查或活檢并不能提高腹膜轉移的早期檢出率。因此，需要新的預測標志物來發現早期腹膜轉移，以改善晚期胃癌的預后。加權基因共表達網絡分析(weighed gene co-expression network analysis,WGCNA)是鑒定疾病涉及的共表達模塊和關鍵基因的有效方法[3]。本研究基于公共微陣列數據集(GSE62254)通過WGCNA鑒定與胃癌腹膜轉移相關的樞紐模塊，基于胃癌TCGA和GEO數據集(GSE62254和GSE84437)篩選胃癌預后相關基因，取樞紐模塊的基因和單因素COX回歸分析有統計學意義的交集基因之一，即含亮氨酸拉鏈和EF手跨膜蛋白2(leucine zipper and EF-hand containing transmembrane protein 2，LETM2),作為胃癌腹膜轉移和預后的候選標志物，通過對胃癌相關組織及腹水或腹腔灌洗液沉渣蠟塊進行免疫組織化學染色(immunohistochemical staining,IHC)表達分析，探討其與胃癌臨床病理特征和對腹膜轉移的預測意義。

1 材料與方法

1.1 材料 GSE62254和GSE84437芯片數據集從基因表達數據庫GEO(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載，分別基于GPL450和GPL6947平臺和文獻獲得300份和454份胃癌樣本基因表達和臨床數據[4-5]。胃癌癌癥基因組圖譜分析(TCGA-STAD)轉錄組數據和臨床數據從http://cancergenome.nih.gov/使用Perl軟件(https://www.perl.org/；5.32.1版本)下載。通過R軟件Limma包和Sva包對數據進行了批量歸一化處理。

1.2 方法

1.2.1 共表達網絡的構建 使用R軟件中的WGCNA包和Limma包對處理后的數據集進行WGCNA分析。首先，通過定義軟閾值(β值)的功效建立標準的無標度網絡，分析網絡模塊的平均連通性和尺度獨立性。使用網絡中每對節點基因與其Pearson 相關系數絕對值構造鄰接矩陣，基于TOM(dissTOM)的分層聚類構建分層聚類樹狀圖，合并相關系數>0.75的模塊。最后，選擇與胃癌腹膜轉移相關分析中相關系數最大、P值絕對值最小的模塊作為樞紐模塊[3]。

1.2.2 基于胃癌數據集分析篩選胃癌預后相關基因 基于不同數據集(GSE62254、GSE84437和TCGA-STAD)的總生存期(overall survival，OS)，以不同基因mRNA表達的最佳截斷值為臨界值，將樣品分成高表達組和低表達組，使用R/Bioconductor軟件中的Survival包對基因表達進行單變量COX生存分析，選擇P<0.05的基因作為預后相關基因。利用VennDiagramR程序包獲取深綠色模塊與3個數據集預后相關基因的交集基因，并繪制韋恩圖，得到與腹膜轉移預后相關的基因LETM2和SERPINE2。因目前LETM2在胃癌的研究文獻報道有限，本研究選擇LETM2作為關鍵基因進行臨床樣本的IHC分析。

1.2.3 IHC分析LETM2在胃癌不同部位的表達及臨床意義 收集2006年8月—2021年12月胃癌手術患者的福爾馬林固定石蠟包埋庫存蠟塊215例，包括腫瘤原發灶(n=215)、腫瘤周圍正常組織(n=215)、淋巴結轉移灶(n=141)、肝轉移灶(n=6)、腹膜轉移灶(n=20)。納入標準：明確的病理診斷，臨床和隨訪數據完整。排除標準：胃腺癌伴異質性成分；失訪者；死于其他疾病而非胃癌者。

采用兔抗人LETM2多克隆抗體(貨號：17180-1-AP，1∶100稀釋，武漢三鷹生物技術有限公司)以及Envision試劑盒(K4010，丹麥DAKO生物技術有限公司),按照抗體說明書對胃癌LETM2進行兩步法IHC檢測。PBS作為陰性對照，胎盤組織作為陽性對照。免疫反應評分(IRS)根據染色強度(SI)和陽性細胞(PP)的百分比的乘積計算，即IRS=SI×PP。染色強度分級如下：0，無染色；1，淡黃色；2，棕黃色；3，棕褐色。陽性細胞百分比：0為≤5%，1為6%～25%，2為26%～50%，3為51%～75%，4為>75%。采用X-tile軟件(V3.6.1)，根據生存數據確定IRS最佳截斷值為7，將LETM2表達分為低表達組和高表達組。

1.2.4 腹水細胞沉渣石蠟包埋IHC分析 收集2015年1月—2021年12月就診的胃癌腹膜轉移患者腹水(n=20)和胃癌患者非腫瘤腹水或腹腔灌洗液細胞蠟塊(n=60)，分別行LETM2 IHC分析。具體操作如下：取200～300 mL 腹水樣本，2 500 r/min 離心10 min，棄上清液；血性腹水加入適量的紅細胞裂解液繼續離心10 min，小鋼匙刮取細胞沉渣置于包埋盒中的擦鏡紙上，包裹后合蓋，置于95%乙醇中固定；經常規脫水處理，石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅(H-E)染色和LETM2 IHC分析，每張切片選取10個高倍視野(×200)，對照H-E染色細胞形態，LETM2著色陽性腫瘤細胞>5為陽性，以臨床和病理診斷最終結果為金標準，評價LETM2在胃癌腹水細胞沉渣蠟塊切片IHC分析對胃癌腹膜轉移的預測價值[4]。

2 結 果

2.1 基于WGCNA和數據集預后分析篩選胃癌腹膜轉移預后相關候選基因 利用WGCNA篩選出與胃癌腹膜轉移相關系數最大、P值最小的深綠色模塊(r=0.32，P=1.1×10-8，圖1)作為關鍵模塊，共包含6 936個基因。根據基因mRNA表達的最佳截斷值，GSE62254、GSE84437和TCGA單變量COX回歸分析分別得到1 664、1 031和363個預后相關基因(P<0.05)，韋恩圖確定了深綠色模塊基因與3個數據集預后相關基因的交集基因LETM2和SERPINE2，LETM2在不同數據集的K-M生存曲線和Log-rank檢驗提示，LETM2高表達胃癌患者預后差(圖2)。

A：WGCNA分析共獲得與胃癌臨床病理性狀相關的15個關鍵的共表達模塊；B：深綠模塊基因與胃癌腹膜轉移相關性分析結果(r=0.76，P<0.001)；C：模塊-特征關系圖顯示，深綠色模塊與胃癌腹膜轉移相關系數最大，P值最小，從左到右分別為Lauren分型腸型、彌漫型和混合型；T指AJCC的T分期；N指AJCC的N分期；M指AJCC的M分期；pStage指胃癌病理分期；PM指胃癌腹膜轉移，包括癌性腹水或腹膜轉移癌結節；Mol為文獻提供的ARGC分子分型。圖1 基于胃癌數據集WGCNA分析發現胃癌腹膜轉移相關的關鍵模塊Fig.1 Identification of key modules related to peritoneal metastasis based on WGCNA analysis and gastric cancer datasets

A：韋恩圖顯示，深綠色模塊與3個數據集預后相關基因的數目及交集基因個數；B～D：Kaplan-Merier生存分析曲線顯示，LETM2高低表達組胃癌總生存率的差異具有顯著性;B:TCGA-STAD；C:GSE62254;D:GSE84437。圖2 Kaplan-Merier生存曲線分析LETM2高低表達胃癌患者的總生存時間差異Fig.2 Significant difference between high and low expression of LETM2 in gastric cancer was demonstrated by Kaplan-Merier survival analysis

2.2 LETM2蛋白在不同胃癌組織中的表達分析 LEMT2在癌旁胃黏膜、胃癌原發灶、淋巴結轉移灶和肝轉移灶中呈異質性表達(圖3)。原發灶LETM2的表達高于鄰近的正常胃黏膜上皮(6.88±0.24vs2.95±0.13，P<0.000 1)；彌漫型胃腺癌中的表達高于腸型(9.29±0.17vs2.84±0.25，P<0.000 1)。此外，LETM2在腹膜轉移灶中的表達高于原發灶(9.85±0.47vs6.88±0.24，P<0.05)，而原發性灶和肝轉移灶表達比較，差別無統計學意義(6.88±0.24vs5.13±0.72，P>0.05)；淋巴結轉移灶的表達水平低于腫瘤原發灶(3.99±0.21vs6.88±0.24，P<0.05)。

A：癌旁胃黏膜；B：高分化胃腺癌；C：差分化胃腺癌；D：胃癌淋巴結轉移灶；E：胃癌腹膜轉移灶；F：胃癌肝轉移灶。圖3 LETM2在胃癌原發灶和轉移灶的表達分析(IHC ×200)Fig.3 Immunohistochemical analysis of LETM2 in primary and metastatic loci of gastric cancer (IHC ×200)

2.3 LETM2在胃癌原發灶中表達的臨床意義 LETM2高表達與Lauren組織學分型(P<0.001)、pStage(P=0.003)和腹膜轉移(P=0.002)呈正相關，與患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移無相關性(表1)。LETM2高表達的胃癌患者中位生存時間更短[(85.00±4.23)月vs(93.00±6.78)月,P=0.02]，ROC曲線分析顯示，胃癌原發灶LETM2 IHC評分對胃癌腹膜轉移預測的截止值為6.5，曲線下面積為0.626(95%CI:0.519～0.733)，靈敏度為90.0%，特異度為43.0%(圖4)。

A：Kaplan-Merier生存曲線顯示原發灶LETM2高、低表達組胃癌總生存率差異具有顯著性；B：ROC曲線分析原發灶LETM2免疫組織化學染色評分對胃癌腹膜轉移灶的預測價值。圖4 原發灶LETM2表達水平對胃癌預后及腹膜轉移預測評價Fig.4 Evaluation of predictive value of LETM2 expression in primary tumor for prognosis and peritoneal metastasis of gastric cancer

表1 胃癌原發灶LETM2表達與胃癌臨床病理特征相關性分析Tab.1 Correlation of LETM2 expression with clinicopathologic characteristics of gastric cancer

2.4 腹水細胞沉渣蠟塊LETM2 IHC分析對胃癌腹膜轉移的診斷評價 LETM2在胃癌腹膜轉移腹水IHC強度大于炎癥細胞(圖5)，以經病理和臨床證實陰性的胃癌患者腹腔沖洗液/腹水為陰性對照組，病理和臨床診斷明確的胃癌患者腹水細胞沉渣為陽性對照組，LETM2 IHC分析結果顯示，20例胃癌腹水細胞LETM2陽性表達率(靈敏度)為15/20(75.0%)，陰性表達率為5/20(25.0%)；陰性對照組陽性表達率為10/60(16.7%)，陰性表達率(特異度)為50/60(83.3%)(表2)。

表2 胃癌腹水轉移灶中LETM2免疫組織化學染色檢測的靈敏度和特異度分析Tab.2 Sensitivity and specificity of the LETM2 immunohistochemical detection in sections from peritoneal metastatic loci of gastric cancer

A：胃癌患者陰性腹水細胞沉渣蠟塊LETM2免疫組織化學染色，右上角為黑框內炎癥細胞局部放大；B：胃癌患者陽性腹水細胞沉渣LETM2免疫組織化學染色，右上角為黑框內腫瘤細胞局部放大。圖5 腹水沉渣細胞蠟塊LETM2免疫組織化學染色(IHC ×200)Fig.5 LETM2 immunohistochemical staining in sections from paraffin-embedded blocks of cells from ascites(IHC ×200)

3 討 論

腹膜轉移是胃癌患者復發和死亡的主要原因之一，預示預后不良，治療方式選擇有限[2]。開發用于早期檢測的生物標志物有助于晚期胃癌患者的個體化臨床化療方案選擇和改善臨床預后。本研究旨在通過生物信息學數據分析和IHC檢測，尋找新的腹膜轉移預測的敏感和特異性分子標志物。首先基于胃癌數據集GSE62254和WGCNA分析發現腹膜轉移相關的樞紐模塊，其次基于3個數據集基因表達譜數據(GSE62254、GSE84437和TCGA-STAD)和患者生存數據確定胃癌預后相關的關鍵基因，二者的交集基因之一LETM2被確定為胃癌腹膜轉移和預后相關的候選基因。相比于正常胃黏膜和高分化胃腺癌，IHC在原發灶和腹膜轉移中檢測到LETM2蛋白在彌漫型胃腺癌和腹膜轉移灶中高表達。胃癌原發灶LETM2過表達與胃癌分化程度、病理分期和腹膜轉移呈正相關。3個胃癌數據COX回歸分析和臨床樣本IHC分析均發現，LEMT2過表達的胃癌患者總體生存時間短，可能是胃癌患者總生存率的潛在預測指標。

LETM2基因位于第8號染色體，約含有27 000個堿基，編碼線粒體內含有LETM1結構域的蛋白2(LETM2)，具有4個選擇性剪接變異亞型。其中Q2VYF4-1被認為是經典序列，包含胞外螺旋卷曲、轉運肽、跨膜區和跨膜螺旋4個基序，而Q2VYF4-2丟失1～47氨基酸，Q2VYF4-3分別丟失1～47和168～215氨基酸，Q2VYF4-4丟失1～214氨基酸，215位氨基酸出現了錯義突變(p.Lys215Met)(https://www.uniprot.org/uniprot/Q2VYF4#Q2VYF4-1)。

LETM2在睪丸組織中表達最高，也可以在內分泌組織、胃腸道、生殖系統、骨髓和淋巴組織中檢測到。除膠質瘤和淋巴瘤外，大多數腫瘤組織表現出不同強度的LETM2細胞質陽性(https://www.proteinatlas.org/)。本研究LETM2在胃癌細胞質中表達的IHC分析結果與之一致。LETM2在正常胃上皮中表現出較低的表達，但在原發性腫瘤中表現出較高的表達，特別是分化差或腹膜轉移病灶。IHC分析結果揭示了LETM2在胃癌進展和腹膜轉移的潛在作用，但由于不可切除的原因，來自腹膜轉移灶的檢測樣本數量有限，需要多中心研究進一步驗證。本研究未能觀察到胃癌原發腫瘤與肝臟轉移灶之間的差異表達，且淋巴結轉移灶平均陽性率低于腫瘤原發灶。原因可能如下：首先，肝臟和淋巴結的轉移灶太小，通過染色區域和強度的測量存在一定偏倚[5]。此外，為減少肝臟染色的非特異性背景，IHC分析過程降低了原發性腫瘤中使用的抗體濃度，增加了切片封閉時間，可能會在一定程度上降低染色強度[6]。再者，眾所周知，腹膜轉移和實體器官轉移具有不同的轉移途徑[7]，筆者假設LETM2可能在腹膜和遠處轉移中發揮直接或間接的作用，因為LETM2染色在淋巴結血管中強表達，不排除其通過血管促進胃癌淋巴結轉移。

本研究發現，胃癌原發灶LETM2 IHC分析對胃癌腹膜轉移灶預測具有一定的特異性和敏感性，其在腹水細胞沉渣石蠟包埋切片組織中陽性胃癌細胞的假陽性率和假陰性率相對較低。腹水細胞沉渣蠟塊IHC檢測與單純細胞病理檢測相比，具有以下優勢：一是細胞相對集中，細胞結構完整，提高了細胞學檢查的陽性率；二是蠟塊可以長期保存，反復切片，進行IHC分析，結合臨床病史，確定腫瘤細胞的組織來源。通過比對H-E切片，腹膜轉移灶中胃癌細胞IHC強度高于陰性對照組的間皮細胞和炎癥細胞，包括組織細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等，有助于胃癌腹水轉移灶中癌細胞的識別。雖然LETM2 IHC分析腹膜轉移灶癌細胞檢測具有較高的敏感性，但特異性尚需進行多中心采集胃癌和其他癌癥腹膜轉移樣本進一步驗證，且多指標聯合檢測更有助于提高陽性檢測值。

在一項255個胃腺癌樣本的研究中，LETM2被認為與TCGA分子亞型之一染色體不穩定型(CIN)相關[8]。本研究發現，LETM2過表達與彌漫性胃腺癌呈正相關，彌漫性胃腺癌與TCGA-STAD分子亞型基因穩定型(GS)重疊，具有高轉移潛能。這種研究差異可能源于發病部位和檢測方法，病變大都從胃體和胃竇獲得，CIN亞型更常見于胃食管連接處，不排除LETM2影響胃癌發病和進展可能因部位不同，分子機制不同，需要體內和體外實驗進一步驗證。

綜上所述，通過WGCNA方法篩選3個數據集中與胃癌預后相關的基因集，將LETM2確定為晚期胃癌腹膜轉移和預后的潛在預測標志物。臨床樣品的IHC分析進一步證實了LETM2預測胃癌細胞腹膜轉移的潛能，但多中心多指標聯合檢測有助于提高晚期胃癌患者腹膜微小轉移灶的敏感性和特異性。