葛根素調控miR-30e-5p緩解高糖所致的足細胞損傷*

梅蘭，郭陽，張寧，傅盼盼，孫國鈞

1.北部戰區總醫院和平院區，遼寧 沈陽 110000； 2.大連市友誼醫院，遼寧 大連 116000

糖尿病腎病是糖尿病常見并發癥之一，其發病率逐年上升，已嚴重影響患者生活質量，隨著疾病進展糖尿病腎病最終發展為終末期腎病。然而，糖尿病腎病的發病機制尚未完全闡明。研究發現，足細胞損傷可引起糖尿病腎病的發生，而足細胞凋亡、內質網應激等均可誘導足細胞損傷[1]。目前，臨床尚缺乏防治足細胞損傷的方法，既往研究顯示，中醫藥在抗氧化、抗炎及腎臟保護方面具有獨特的優勢[2-3]。葛根素為中藥葛根的主要成分，具有降血糖等作用，還可通過調控尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(recombinant nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4)的表達抑制糖尿病腎病的發展進程[4]，但關于葛根素治療糖尿病腎病的分子機制尚未完全闡明。微小RNA(miRNA，miR)在糖尿病腎病發病機制中發揮重要調控作用，其可通過調控靶mRNA的表達參與足細胞損傷過程[5]。研究表明，miR-30e-5p在糖尿病腎病患者中表達水平降低，并可能參與糖尿病腎病的發生過程[6]。基于此，本研究采用高糖誘導小鼠腎足細胞MPC5建立足細胞損傷模型，探討葛根素能否通過調控miR-30e-5p的表達抑制高糖誘導的足細胞損傷，并初步探究其可能的作用機制。

1 材料

1.1 細胞小鼠腎足細胞MPC5購自上海聯邁生物工程有限公司(貨號：LHY2125)。

1.2 藥物與試劑葛根素(純度≥98%，美國Sigma公司，批號：20190203)；葡萄糖(北京酷來搏科技有限公司，批號：20190105)；Lipofectamine2000(南京信帆生物技術有限公司，批號：20190106)；Trizol試劑(北京全式金生物技術有限公司，批號：20190207)；miRcute 增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、Quant one step RT-qPCR 試劑盒(SYBR Green)(北京天根生化科技有限公司，批號：20190211、20181223)；細胞凋亡檢測試劑盒(北京博邁斯科技發展有限公司，批號：20181215)；兔抗鼠半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific protease-3，caspase-3)抗體、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)抗體(美國Santa Cruz公司，批號：20190108、20190122、20190116)；兔抗鼠p62抗體、微管相關蛋白輕鏈3Ⅱ(microtubule-associated protein l light chain 3，LC3-Ⅱ)抗體、LC3-Ⅰ抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(美國CST公司，批號：20190124、20190201、2019021、120190119)；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(美國Abcam公司，批號：20190203)；miR-30e-5p寡核苷酸模擬物(miR-30e-5pmimics)及陰性對照序列(miR-NC)、miR-30e-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-30e-5p)及其陰性對照(anti-miR-NC)(廣州銳博生物科技有限公司，批號：20190132、20190136、20190096、20190138)；miR-30e-5p引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。

1.3 儀器FACS Calibur型流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)；7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；DYY-7C型電泳儀電源、DYCZ-24DN型垂直電泳槽、DYY-12型電泳儀(北京六一儀器廠)；JY02S型紫外分析儀、JY-SPCT型水平電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；Nano-100型微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司)；mμlISKANMK3型酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；HI650型離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

2 方法

2.1 分組與干預MPC5細胞常規培養，調整細胞密度為3×105mL-1，接種于96孔板，每孔 100 μL，分為對照組、模型組、低劑量葛根素組、中劑量葛根素組及高劑量葛根素組。對照組加入含有濃度為5.5 mmol·L-1葡萄糖的培養液，模型組加入含有濃度為30 mmol·L-1葡萄糖的培養液[7]，低、中、高劑量葛根素組分別加入含有30 mmol·L-1葡萄糖及不同劑量(1 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1)葛根素[8]的培養液，培養24 h后進行指標檢測。miR-NC、miR-30e-5pmimics轉染至MPC5細胞后，加入含有濃度為30 mmol·L-1葡萄糖的培養液培養24 h，分別記作miR-NC組、miR-30e-5p組。anti-miR-NC、anti-miR-30e-5p轉染至MPC5細胞，分別加入含有10 μmol·L-1葛根素與30 mmol·L-1葡萄糖的培養液培養24 h，分別記作高劑量葛根素+anti-miR-NC組、高劑量葛根素+anti-miR-30e-5p組。

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率取各組MPC5細胞加入預冷PBS洗滌，棄上清，加入500 μL緩沖液重懸細胞，參照細胞凋亡檢測試劑盒說明書分別加入Annexin V-FITC與PI，應用FACS Calibur流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

2.3 RT-qPCR檢測MPC5細胞中miR-30e-5p的表達水平采用Trizol法提取各組MPC5細胞中的總RNA，反轉錄成cDNA，反轉錄體系：5×gDNA Buffer 2 μL，10×King RT Buffer 2 μL，FastKing RT Enzyme Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，RNA 2 μg，RNase-Free ddH2O補足體系至20 μL；反應條件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。RT-qPCR擴增，反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補足體系至25 μL，應用熒光定量PCR儀檢測miR-30e-5p相對表達量。miR-30e-5p正向引物序列：5′-GGGTGTAAACATCCTTGAC-3′，反向引物序列：5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6正向引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2.4 Western Blot檢測caspase-3、Bax、Bcl-2、p62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的蛋白表達量提取各組MPC5細胞總蛋白進行定量，蛋白變性后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，轉移至聚偏氟乙烯(vinylidene fluoride，PVDF)膜，使用5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗孵育(稀釋11 000)24 h，孵育二抗(稀釋比例13 000) 1 h，暗室內曝光顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值，并計算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。

3 結果

3.1 葛根素對高糖誘導的MPC5細胞凋亡的影響與對照組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，caspase-3、Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中劑量葛根素組、高劑量葛根素組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，caspase-3、Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與中劑量葛根素組比較，高劑量葛根素組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，caspase-3、Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 葛根素對高糖誘導的MPC5細胞凋亡的影響

注：A：細胞凋亡流式圖；B：凋亡相關蛋白表達圖圖1 葛根素對高糖誘導的MPC5細胞凋亡的影響

3.2 葛根素對高糖誘導的MPC5細胞自噬的影響與對照組比較，模型組p62蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中劑量葛根素組、高劑量葛根素組p62蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.05)；與中劑量葛根素組比較，高劑量葛根素組p62蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 葛根素對高糖誘導的MPC5細胞自噬的影響

3.3 葛根素對高糖誘導的MPC5細胞中miR-30e-5p表達的影響與對照組比較，模型組miR-30e-5p的表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中劑量葛根素組、高劑量葛根素組miR-30e-5p的表達水平顯著升高(P<0.05)；與中劑量葛根素組比較，高劑量葛根素組miR-30e-5p的表達水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

表2 葛根素對高糖誘導的MPC5細胞自噬的影響

表3 葛根素對高糖誘導的MPC5細胞中miR-30e-5p表達的影響

3.4 過表達miR-30e-5p對高糖誘導的MPC5細胞凋亡及自噬的影響與miR-NC組比較，miR-30e-5p組細胞凋亡率及caspase-3、Bax、p62蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.05)。見圖3，表4。

注：A：細胞凋亡流式圖；B：凋亡及自噬相關蛋白表達圖圖3 過表達miR-30e-5p對高糖誘導的MPC5細胞凋亡及自噬的影響

表4 過表達miR-30e-5p對高糖誘導的MPC5細胞凋亡及自噬的影響

3.5 干擾miR-30e-5p的表達能逆轉葛根素對高糖誘導的MPC5細胞凋亡及自噬的影響與高劑量葛根素+anti-miR-NC組比較，高劑量葛根素+anti-miR-30e-5p組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，caspase-3、Bax、p62蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低(P<0.05)。見圖4、表5。

注：A：細胞凋亡流式圖；B：凋亡及自噬相關蛋白表達圖圖4 干擾miR-30e-5p能逆轉葛根素對高糖誘導的MPC5細胞凋亡及自噬的影響

表5 干擾miR-30e-5p能逆轉葛根素對高糖誘導的MPC5細胞凋亡及自噬的影響

4 討論

糖尿病腎病是引發終末期腎病的重要原因之一，目前臨床尚缺乏防治糖尿病腎病進展的有效措施[9-11]。近年來的研究發現，中醫藥可通過減輕足細胞損傷對糖尿病腎病的防治發揮作用[12-16]，也可通過調控多種基因或信號通路表達減緩糖尿病腎病的發展進程[17-20]。因而，積極探尋新型糖尿病腎病的治療藥物并探究其可能作用機制，成為防治糖尿病腎病的新方向。

葛根素是葛根的主要成分，具有改善心腦血管循環、抑制心肌細胞凋亡等作用，可通過抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路抑制缺血再灌注所致的心肌細胞凋亡[21]，還可通過抑制線粒體解偶聯蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)的表達保護2型糖尿病大鼠胰腺β細胞[22]，通過上調miR-155-3p的表達抑制髓樣分化因子(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)的表達從而減輕血管內皮小細胞損傷[23]。本研究結果顯示，高糖處理后，足細胞凋亡率明顯提高，與相關文獻報道結果一致[24]，提示高糖誘導可成功建立足細胞損傷模型。使用不同劑量的葛根素處理后，高糖誘導的足細胞凋亡率明顯降低，caspase-3、Bax蛋白表達水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，且呈劑量依賴性，提示葛根素可抑制高糖誘導的足細胞凋亡從而減輕細胞損傷。自噬與細胞凋亡密切相關，自噬的主要過程為細胞將自身胞質內蛋白或細胞器包被后與溶酶體形成自噬小體進而降解細胞，自噬發生時LC3-Ⅰ轉變為LC3-Ⅱ，p62與LC3偶聯從而參與自噬過程[25]。本研究結果顯示，高糖處理足細胞后可明顯提高p62蛋白表達水平，降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，而葛根素可明顯降低p62的表達水平，提高 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，且呈劑量依賴性，提示葛根素可能通過誘導細胞自噬而調控細胞凋亡。

研究表明，miR-30e-5p可減輕缺氧誘導的心肌細胞凋亡[26]。miR-30e-5p通過調控去整合素-金屬蛋白酶9(disintegrin-metalloproteinase 9，ADAM9)抑制血管緊張素II誘導的心肌細胞肥大[27]。本研究發現，高糖誘導的足細胞中miR-30e-5p的表達水平降低，而葛根素可明顯提高miR-30e-5p的表達水平，提示葛根素可能通過促進miR-30e-5p的表達減輕高糖誘導的足細胞損傷。本研究進一步分析顯示，miR-30e-5p過表達可明顯降低高糖誘導的足細胞凋亡率，抑制caspase-3、Bax、p62的表達，促進Bcl-2的表達，并可提高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，提示miR-30e-5p過表達可抑制高糖誘導的足細胞凋亡從而減輕足細胞損傷。

綜上所述，葛根素可通過上調miR-30e-5p的表達抑制高糖誘導的足細胞凋亡從而減輕細胞損傷，其作用機制可能與誘導細胞自噬有關，為進一步揭示葛根素治療糖尿病腎病的分子機制奠定實驗基礎。