遠志皂苷B對電離輻射損傷的保護作用及機制研究*

職小飛，徐萍，張克清，李相中

1.鄭州大學第一附屬醫院附屬安陽醫院，河南 安陽 455003； 2.新鄉醫學院，河南 新鄉 453003； 3.安陽市中醫院，河南 安陽 455003

隨著科學技術的發展，人們暴露于各類射線的概率日益增加，受到輻射的概率也大為增加，因此尋求有效地防治輻射的藥物也日顯重要[1]。電離輻射是最常見的輻射，可以引起頭暈、乏力、食欲下降等免疫力低下的癥狀[2]。遠志皂苷B為藥材遠志中的化合物，具有抗衰老、抗抑郁、鎮靜、祛痰鎮咳、抗癌、抗誘變和增強免疫力等藥理作用[3-6]。前期研究發現，遠志皂苷B可以減輕電離輻射的損傷[7-8]，但其作用機制有待于進一步研究。為進一步探明遠志皂苷B減輕電離輻射損傷的作用機理，本實驗擬采用電離輻射損傷小鼠模型，通過觀察胸腺組織中核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)抑制因子α (inhibitor of NF-κBα，IκBα)、p53、半胱氨酸蛋白酶-3 (caspase-3)的基因和蛋白表達水平，探究其減輕電離輻射損傷的作用機理。

1 材料

1.1 動物120只SPF級雄性BALB/c小鼠，8～12周齡，體質量為(25±2) g，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2015-0018。小鼠飼養房內恒溫(23±2) ℃、恒濕(濕度50%)，光照時間為800—2000，且動物被允許自由攝食飲水。本研究所涉及的所有實驗均按照中華人民共和國科技部發布的實驗動物管理條例執行。

1.2 藥物及試劑遠志皂苷B(成都德思特生物技術有限公司，純度98.9%，批號：DY0088)。Trizol、Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：15596018、4367659)；Takara逆轉錄試劑盒(大連Takara公司，批號：9767)；IκBα兔抗鼠抗體、p-IκBα兔抗鼠抗體、p53兔抗鼠抗體、caspase-3兔抗鼠抗體、GAPDH抗體(德國Merck公司，批號：P36896、P11021、P29147、P42574、P04406)；羊抗兔二抗(武漢博士德生物公司，批號：20180211)；引物合成由南京金斯瑞生物科技公司完成。

1.3 儀器Practum型電子天平(德國SARTORIUS公司)；XFA6100型血球儀(北京普朗新技術有限公司)；EnSight型多功能酶標儀(美國PERKINELMER公司)；QIAxcel Advanced型核酸蛋白分析儀(德國Qiagen公司)；MyCycler型PCR擴增儀、Gel Doc EZ型全自動免染凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)；Centrifuge 5418 R型離心機(Eppendorf公司，離心半徑：76 mm)。

2 方法

2.1 動物分組、模型建立及給藥適應性飼養1周后，將120只SPF級雄性BALB/c小鼠隨機分為空白組、模型組、遠志皂苷B低劑量組和遠志皂苷B高劑量組，每組30只。除空白組外，其他組小鼠根據參考文獻描述進行全身一次性5.5 Gy γ射線照射3 h建立電離輻射損傷模型[9]。造模完成的第2天開始給藥，遠志皂苷B低、高劑量組以10 mL·kg-1的體積分別灌胃給予10 mg·kg-1、20 mg·kg-1的遠志皂苷B溶液，空白組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，持續給藥4周。小鼠飼養期間，記錄造模后及給藥期間體質量的變化及動物死亡數和死亡時間，每7天稱量1次小鼠的體質量。

2.2 小鼠外周血淋巴細胞計數和胸腺系數檢測末次給藥結束后24 h，稱取體質量，摘眼球取血，使用血球儀計數外周血淋巴細胞數，并計算百分率。取血后頸部脫臼處死小鼠，取胸腺，分離脂肪和韌帶，擦干血水，稱取質量，計算胸腺系數。

胸腺系數=胸腺質量/體質量×100%

2.3 RT-PCR檢測胸腺中IκBαmRNA、p53mRNA、caspase-3mRNA的表達摘眼球取血后，頸部脫臼處死小鼠，取胸腺。Trizol法提取胸腺總mRNA，提取后用核酸蛋白儀檢測純度，純度為 1.8～2.2即合格；按照Takara逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，按照Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書操作完成后，置于PCR儀進行基因擴增，反應體系如下：SYBR Green PCR Master Mix 25 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；dNTP 2 μL；cDNA模板2 μL；加入ddH2O使總體積達50 μL。反應條件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，45個循環；72 ℃ 10 min。用2-△△Ct表示mRNA相對表達水平。使用Primer Premier 5 設計IκBα、p53、caspase-3及內參GAPDH引物，序列見表1。

2.4 Western Bolt檢測胸腺內IκBα、p-IκBα、p53、caspase-3蛋白表達量取胸腺組織50 mg，加蛋白裂解液，研磨，12 000 r·min-1離心30 min，取上清，使用BCA法檢測各組蛋白總量；加樣后使用10%凝膠，80 V電泳至分離后轉至120 V電泳至膠下緣，100 V 90 min轉膜，5%脫脂奶封閉2 h；分別加入IκBα、p-IκBα、p53和caspase-3一抗(稀釋比例為11 000)，置4 ℃冰箱過夜，洗膜，再加入二抗(稀釋比例為15 000)，洗膜，11配置ECL工作液顯影；置于凝膠圖像成像分析系統，曝光蛋白條帶，拍照并分析各組條帶灰度值。

表1 引物序列

3 結果

3.1 各組小鼠體質量比較與空白組比較，第8天、第15天、第22天及第29天模型組小鼠體質量顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，第8天、第15天、第22天及第29天遠志皂苷B各給藥組小鼠體質量均顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠不同時期體質量變化比較

3.2 各組小鼠外周血淋巴細胞計數和胸腺系數比較與空白組比較，模型組小鼠外周血淋巴細胞數、淋巴細胞百分率和胸腺系數明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，遠志皂苷B低劑量組小鼠外周血淋巴細胞數極顯著性升高(P<0.01)，淋巴細胞百分率和胸腺系數顯著升高(P<0.05)；遠志皂苷B高劑量組小鼠外周血淋巴細胞數和胸腺系數顯著升高(P<0.05)，淋巴細胞百分率極顯著升高(P<0.01)。見表3。

表3 遠志皂苷B對小鼠淋巴細胞數及百分率、胸腺系數的影響

3.3 各組小鼠4周內平均存活時間和生存率比較空白組小鼠4周內無死亡，平均存活時間為 30 d，生存率為100%；模型組小鼠從第5天開始死亡，30 d內死亡19只，平均存活時間為19.77 d，生存率為36.70%；遠志皂苷B低劑量組小鼠從第7天開始死亡，30 d內死亡15只，平均存活時間為24.30 d，生存率為50%；遠志皂苷B高劑量組小鼠從第8天開始死亡，30 d內死亡12只，平均存活時間為26.10 d，生存率為60%。與空白組比較，模型組小鼠平均存活時間和生存率均顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，遠志皂苷B高劑量組的平均存活時間和生存率均顯著增加(P<0.05)。見圖1及表4。

表4 遠志皂苷B對小鼠生存時間的影響

圖1 各組小鼠4周生存率比較

3.4 RT-PCR檢測結果比較與空白組比較，模型組小鼠胸腺中IκBαmRNA表達水平明顯降低(P<0.01)，p53mRNA、caspase-3mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，遠志皂苷B低劑量組小鼠胸腺中IκBαmRNA表達水平顯著上升(P<0.05)，p53mRNA、caspase-3mRNA表達水平極顯著性下降(P<0.01)；遠志皂苷B高劑量組小鼠胸腺中IκBαmRNA表達水平極顯著性上升(P<0.01)，p53mRNA表達水平極顯著性下降(P<0.01)，而caspase-3mRNA表達水平顯著下降(P<0.05)。見表5。

表5 各組小鼠胸腺中IκBα、p-IκBα、p53、caspase-3的mRNA表達水平比較

3.5 Western bolt檢測結果比較與空白組比較，模型組小鼠胸腺中IκBα蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，而p-IκBα、p53、caspase-3蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，遠志皂苷B各劑量組小鼠胸腺中IκBα蛋白表達水平明顯上升(P<0.05)，而p-IκBα、p53、caspase-3蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。見表6和圖2。

表6 各組小鼠胸腺中IκBα、p-IκBα、p53、caspase-3蛋白表達水平比較

注：A：空白組；B：遠志皂苷B高劑量組；C:遠志皂苷B低劑量組；D:模型組圖4 各組小鼠胸腺中IκBα、p-IκBα、p53、caspase-3蛋白條帶圖

4 討論

中醫認為，免疫力屬于衛氣范疇，而衛氣源于腎陽，屬陽，腎為先天之本，一身陰陽之根本，故腎陽為衛陽產生之根本，腎陽充足則衛陽充足。周學海在《讀醫隨筆》中云：“衛氣者，本于命門，達于三焦”[10-11]。中藥遠志味苦、辛，性溫，歸心、肺、腎經，具有安神益智、交通心腎、祛痰消腫等功效，臨床可治療失眠、健忘、咳嗽痰多、癰疽瘡毒等。遠志性溫屬陽，歸腎經，溫腎陽而增強衛氣，具有提高免疫力的作用。遠志皂苷B作為中藥遠志的主要有效成分，具有多種藥理活性，其臨床應用十分廣泛，可用于治療阿爾茨海默病、心腦血管疾病及癲癇等[12-13]；還可配茯神、龍齒等中藥，以化痰濕健脾，交通心腎，安神助眠[14-15]。此外，也有研究報道，遠志皂苷有抗炎、提高免疫功能的作用[16-17]，但其具體的機制仍需進一步探討。

免疫功能低下是最常見的輻射損傷，患者常有乏力、倦怠、食欲低下、體質量下降、精神不佳等癥狀，實驗室檢查可發現，輻射損傷患者具有外周血淋巴細胞數、淋巴細胞百分率和胸腺系數較低的表現[18-19]。胸腺是機體調節免疫功能的重要免疫器官，但其對輻射敏感度高，常受輻射損傷[20-21]。淋巴細胞是機體內特異性免疫細胞，同樣對輻射敏感[22-23]。輻射損傷后，淋巴細胞DNA合成障礙，從而引起淋巴細胞數量和百分率降低。本實驗發現，遠志皂苷B尤其是高劑量不僅可有效提高小鼠外周血淋巴細胞數、淋巴細胞百分率和胸腺系數，還可以延長小鼠4周內存活時間，提高4周生存率。提示遠志皂苷B對輻射損傷小鼠具有免疫保護作用。

NF-κB是體內介導細胞增殖分化和誘導細胞凋亡的關鍵性轉錄因子[24]。正常情況下，NF-κB與IκB結合以無活性的二聚體滯留于細胞質內。淋巴細胞受損后，IκB發生磷酸化，與NF-κB解離，NF-κB解離后進入細胞核進而誘導淋巴細胞凋亡，而IκBα是IκB蛋白家族的主要成員，是 NF-κB 活化的敏感標志之一[25]。本實驗發現，模型組小鼠胸腺內IκBαmRNA和蛋白表達水平較低，p-IκBα 蛋白表達水平較高，而遠志皂苷B尤其是高劑量組IκBαmRNA和蛋白表達水平升高，p-IκBα 蛋白表達水平降低，說明遠志皂苷B尤其是高劑量能抑制IκBα的磷酸化，從而抑制NF-κB的激活，這可能是其抑制電離輻射后淋巴細胞凋亡的機制。

激活的NF-κB會上調許多促凋亡靶基因，其中p53是NF-κB介導淋巴細胞凋亡的靶基因之一，p53的活化會加重淋巴細胞凋亡。本實驗結果顯示，模型組小鼠胸腺內p53mRNA和蛋白表達增高，遠志皂苷B則能明顯抑制p53mRNA和蛋白的表達。細胞凋亡還受到caspases的調控，細胞凋亡最終都是通過激活caspases而實現的。caspase-3是caspases家族中最關鍵的凋亡執行蛋白酶[26]。本實驗發現，遠志皂苷B能明顯降低電離輻射損傷后胸腺中caspase-3的表達。

綜上所述，遠志皂苷B可通過抑制胸腺組織中NF-κB的激活抑制電離輻射損傷后胸腺中淋巴細胞凋亡的發生，對電離輻射損傷小鼠產生免疫保護作用。