基于TGF-β1/Smads信號通路探討抗纖益心方對心肌纖維化時相性對擴張型心肌病模型大鼠的影響*

聶恒，黃斌，蘇帆

1.河南中醫藥大學第二附屬醫院/河南省中醫院，河南 鄭州 450000； 2.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)為臨床常見的原發性心肌病，該病發病隱匿，多數患者出現明顯心衰癥狀時才得以確診，錯過了最佳治療時期，且發病率逐年升高，嚴重威脅人類健康[1]。研究表明，心肌纖維化導致的心室重構是DCM發病的重要病理基礎，而轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smads信號通路在心肌纖維化的變化過程中發揮著重要的作用[2]。抗纖益心方為河南省中醫院心病科臨床治療DCM的經驗方，具有益氣活血的功效，能改善患者癥狀，提高其生活質量[3]。研究表明，抗纖益心方能夠抑制DCM模型大鼠的心室重構[4]，但此機制仍需進一步的探討。本研究通過觀察DCM大鼠模型心肌纖維化過程中及抗纖益心方干預后大鼠超聲心電圖、活性因子及心肌纖維化相關指標，明確TGF-β1/Smads信號通路在心肌纖維化中的時相性變化及抗纖益心方對TGF-β1/Smads信號通路的干預效果，以便選擇合適的時間用藥，既減輕患者的治療花費，又能最大效率的治療疾病，開拓DCM研究思路，為臨床治療提供根據。

1 材料

1.1 動物SPF級Wistar 健康雄性大鼠140只，體質量100～120 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK (京) 2012-0001，所有實驗動物飼養于河南省中醫院中心實驗室動物飼養中心，22～25 ℃、50%濕度自由攝食、飲水，正常飼養1周后進行模型制備。本實驗獲得實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑抗纖益心方干浸膏(由黨參，黃芪，茯苓，白術，丹參，益母草，川芎，紅花，赤芍，澤蘭組成，河南省中醫院制劑室提供)；呋喃唑酮片(福建省三明天泰制藥有限公司，批號：20150505)；貝那普利片 (常州制藥廠，批號：20150308)。戊巴比妥鈉[中國醫藥(集團)上海化學試劑公司，批號：20150204]；RIPA裂解液(美國Sigma公司，批號：20150703)；TGF-β1、GAPDH抗體(美國BD公司，批號：20140623、20150203)；羊抗兔二抗(美國CST公司，批號：20150601)；免疫組化試劑盒(上海長島生物有限公司，貨號：D-3005)；trizol(美國Invitrogen公司，批號：15596-026)；PCR試劑盒、TaKaRa逆轉錄試劑盒(日本Takara Bio公司，貨號：RR430A、RR036A)；蛋白提取試劑盒、BCA檢測試劑盒(南京建成生物研究所，批號：20150508、20150126)。

1.3 儀器彩色多普勒超聲檢測儀(德國西門子股份公司，型號：Acuson Cypress)；石蠟切片機(湖北慧達儀器公司，型號：HD-325)；組織包埋機(湖北慧達儀器公司，型號：HD-310)；熒光顯微鏡(奧林巴斯，型號：CKX41)；凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司，型號：164-5070)。

2 方法

2.1 動物模型復制及分組、給藥采用呋喃唑酮水溶液(700 mg·kg-1)喂養大鼠復制DCM模型。將模型制備成功的大鼠隨機分為造模組、模型對照組及給藥組(小劑量抗纖益心方組、大劑量抗纖益心方組貝那普利組、聯合用藥組)，造模組又分為空白對照組及模型2周組、4周組、6周組、8周組、10周組、12周組、14周組、16周組，每組10只大鼠。所有組全程給予呋喃唑酮飲水喂養，造模組、模型對照組不給予藥物干預，給藥組均于造模6周后開始給藥，連續8周：小劑量抗纖益心方組、大劑量抗纖益心方組、貝那普利組分別給予抗纖益心方4.7 g·kg-1、抗纖益心方18.8 g·kg-1、貝那普利10.125 mg·kg-1，聯合用藥組每日給予抗纖益心方18.8 g·kg-1+貝那普利10.125 mg·kg-1。

2.2 大鼠一般狀況開始造模后每天觀察大鼠的活躍度、皮膚毛發、精神狀況、平均飲食和飲水量等，并于每周檢測體質量變化。

2.3 大鼠超聲心動圖各組大鼠共140只在其對應時間點，以體積分數1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)腹腔內注射麻醉后行心臟超聲心動圖檢測左心室收縮末期內徑(left ventricular end systolic diameter，LVDs)、左心室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter，LVDd)。取3個測量值后取平均值計算射血分數(ejection fractions，EF)及左室質量指數(left ventricular mass index，LVMI)。

2.4 心肌取材、處理及保存用體積分數1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠后，迅速打開胸腔，以祛酶剪刀剪除大鼠心臟，1‰DEPC水沖洗殘留血液，去除大血管、心外膜脂肪組織，放于祛酶錫箔紙上，將左心室分割兩份。一份置于10%中性福爾馬林中保存24 h，然后經酒精逐梯脫水，二甲苯透明，用熔點為60 ℃及54 ℃的石蠟浸透4 h，石蠟包埋備用。另一份以祛酶錫箔紙包裹，標記相應大鼠編號后，浸入液氮罐，1 h后轉入-80 ℃冰箱存放，待檢。

2.4.1 HE染色觀察大鼠心肌病理形態將上述已經過脫水、透明、浸蠟、包埋的心肌組織進行切片、脫洗、HE染色，顯微鏡下觀察病理學形態變化。

2.4.2 免疫組化檢測心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1的表達取大鼠心肌組織石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min。每張切片加入1滴過氧化物酶阻斷溶液，用來阻斷內源性過氧化物酶活性，室溫孵育10 min。PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加1滴非免疫性動物血清，室溫孵育10 min。除去血清，每張切片加1滴稀釋的一抗，4 ℃過夜。取出放至室溫，PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加1滴生物素標記的二抗，室溫孵育 30 min。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加1滴親和素-過氧化物酶，室溫孵育 30 min。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加2滴新鮮配制的DAB溶液。自來水沖洗，蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。在圖像分析系統上隨機選取相等的5個高倍視野(×400)，每張片子測量OD值后取平均值。染色質含量的高低即陽性染色度的強弱和平均光密度呈正相關。

2.4.3 RT-PCR檢測大鼠心肌TGF-β1/Smads信號通路相關基因的mRNA表達量將各組大鼠心肌組織50 mg運用Trizol法提取總RNA，依照試劑盒固定的步驟進行實驗，用DU800檢測RNA的OD值；用逆轉錄試劑盒將RNA轉錄成cDNA(逆轉錄程序為37 ℃×15 min，85 ℃×5 s)，再進行RT-PCR擴增。PCR引物序列見表1，PCR結果采用ΔCT法對數據進行統計分析。

表1 引物序列

2.4.4 Western Blot法檢測大鼠心肌TGF-β1/Smads通路相關蛋白表達量取各組大鼠心肌組織30 mg進行剪碎后結合400 μL單去污劑裂解液(含PMSF)加入勻漿器中進行勻漿，然后離心5 min后，取上清置于-20 ℃。采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，后進行電泳、轉膜，以含5%脫脂奶粉的TBST 溶液室溫封閉2 h后加入一抗，室溫下孵育1～2 h后，PBS漂洗15 min，連續4次，同上法加入二抗，顯影后用凝膠成像分析系統進行分析。

3 結果

3.1 大鼠一般狀況造模組：隨著造模時間延長，各組大鼠逐步開始出現活動少，反應遲鈍，飲食少，毛發疏松無光澤，體質量減輕等；模型對照組大鼠活動度減弱，進食、飲水減少，體質量減輕，毛色萎黃，大便性狀不一，時溏時常，取材時部分大鼠可見腹腔積液，下肢水腫；各給藥組較模型對照組大鼠更加活躍，癥狀恢復較好。結果表明，各給藥組均可明顯改善大鼠的生活質量，減輕癥狀。

3.2 大鼠超聲心動圖與空白對照組比較，模型2周組、模型4周組、模型6周組大鼠EF無明顯差異(P>0.05)，模型8周組、模型10周組EF顯著性降低(P<0.05)，模型12周組、模型14周組、模型16周組EF極顯著性降低(P<0.01)。與空白對照組比較，模型2周組、模型4周組大鼠LVDd、LVDs無明顯差異(P>0.05)，模型6周組、模型8周組大鼠LVDd、LVDs顯著性升高(P<0.05)，模型10周組、模型12周組、模型14周組、模型16周組大鼠LVDd、LVDs極顯著性升高(P<0.01)。與模型對照組比較，聯合用藥組大鼠EF顯著性升高(P<0.05)，LVDs、LVMI顯著性降低(P<0.05)；貝那普利組LVDs、LVMI顯著性降低(P<0.05)；大劑量抗纖益心方組LVMI顯著性降低(P<0.05)。見表2、表3、表4。

表2 造模組各組左室射血分數及左室內徑比較

表3 各組大鼠左室射血分數及左室內徑比較

表4 各組大鼠LVMI比較

3.3 比較各組大鼠心肌組織病理形態變化觀察造模組結果可以得出：造模成功后，隨著時間的延長心肌纖維排列逐漸紊亂、變形斷裂、間質增生水腫等；觀察治療組結果可以得出：抗纖益心方及貝那普利治療后，心肌纖維排列及組織細胞形態均明顯改善。見圖1、圖2。

注：A：空白組；B：造模4周組；C：造模6周組；D：造模8周組；E：造模16周組圖1 造模各組大鼠心肌病理學損傷變化(HE染色，×200)

3.4 免疫組化檢測大鼠心肌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1的表達與模型對照組比較，大劑量抗纖益心方組、貝那普利組及聯合用藥組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及TGF-β1顯著降低(P<0.05)見表5，圖3、圖4、圖5。

注：A：模型對照組；B：小劑量抗纖益心方組；C：大劑量抗纖益心方組；D：貝那普利組；E：聯合用藥組圖2 各治療組大鼠心肌病理學變化(HE染色，×200)

表5 SP法測各組大鼠心肌內Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1表達

注：A：模型對照組；B：小劑量抗纖益心方組；C：大劑量抗纖益心方組；D：貝那普利組；E：聯合用藥組圖3 免疫組化檢測I型膠原(×400)

注：A：模型對照組；B：小劑量抗纖益心方組；C：大劑量抗纖益心方組；D：貝那普利組；E：聯合用藥組圖4 免疫組化檢測大鼠心肌Ⅲ型膠原變化(×400)

注：A：模型對照組；B：小劑量抗纖益心方組；C：大劑量抗纖益心方組；D：貝那普利組；E：聯合用藥組圖5 免疫組化檢測大鼠心肌TGF-β1變化(×400)

3.5 RT-PCR法檢測大鼠左心室TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7mRNA結果與空白對照組比較，模型4周組TGF-β1mRNA顯著升高(P<0.05)，模型6周組、模型8周組、模型10周組、模型12周組、模型14周組、模型16周組TGF-β1mRNA極顯著性升高(P<0.01)；模型6周組Smad7mRNA顯著降低(P<0.05)，Smad2mRNA、Smad3mRNA、Smad4mRNA顯著升高(P<0.05)，模型8周組、模型10周組、模型12周組、模型14周組、模型16周組Smad7 mRNA極顯著降低(P<0.01)，Smad2mRNA、Smad3mRNA、Smad4mRNA極顯著升高(P<0.01)。與模型對照組比較，小劑量抗纖益心方組Smad7mRNA顯著升高(P<0.05)；大劑量抗纖益心方組與貝那普利組TGF-β1mRNA、Smad2mRNA、Smad3mRNA、Smad4mRNA顯著降低(P<0.05)，Smad7mRNA顯著升高(P<0.05)；聯合用藥組Smad2mRNA、Smad3mRNA顯著降低(P<0.05)，TGF-β1mRNA、Smad4mRNA極顯著性降低(P<0.01)，Smad7mRNA極顯著升高(P<0.01)。見表6、表7。

表6 造模組大鼠左心室TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7基因表達變化

表7 治療組大鼠左心室肌TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7基因表達變化

3.6 Western Blot檢測大鼠左心室TGF-β1，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達結果與空白對照組比較，模型6周組TGF-β1顯著升高(P<0.05)，模型8周組、模型10周組、模型12周組、模型14周組、模型16周組TGF-β1極顯著性升高(P<0.01)；模型4周組Smad7顯著降低(P<0.05)，模型6周組、模型8周組、模型10周組、模型12周組、模型14周組、模型16周組Smad7極顯著降低(P<0.01)。與模型對照組比較，小劑量抗纖益心方組Smad7顯著升高(P<0.05)，TGF-β1顯著降低(P<0.05)；大劑量抗纖益心方組Smad7極顯著升高(P<0.01)，TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4顯著降低(P<0.05)；貝那普利組Smad7極顯著升高(P<0.01)，TGF-β1極顯著性降低(P<0.01)，Smad2、Smad3、Smad4顯著降低(P<0.05)；聯合用藥組Smad2、Smad3、TGF-β1、Smad4極顯著性降低(P<0.01)，Smad7極顯著升高(P<0.01)。見表8、表9及圖6、圖7。

表8 造模組大鼠左心室肌TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達值

表9 治療組大鼠左心室肌TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達值

圖6 各模型組大鼠左心室Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、TGF-β1蛋白表達

圖7 各給藥組大鼠左心室Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、TGF-β1蛋白表達

4 討論

擴張型心肌病主要表現為心室擴張以及收縮功能減弱，1985年美國某地區流行病學調查顯示，DCM患病率為36.5/10萬；2002年中國分層整群抽樣調查顯示，DCM患病率約為19/10萬，且近幾年發病率仍逐漸升高，嚴重影響患者生命健康[5]。DCM病因復雜，感染、自身免疫及遺傳均可導致其發生[6]，雖然DCM的病因及發病機制尚待明確，但不管是由于病毒感染，還是家族遺傳，或者自身免疫反應，又或其他因素所致，其發生發展過程中均會出現細胞間質廣泛纖維化而致的心室重構。

本研究通過灌胃呋喃唑酮水溶液制備DCM大鼠模型，與空白對照組比較，DCM模型組大鼠LVIDs、LVIDd升高，LVEF降低，心肌細胞形態破碎，排列疏松，出現大量的炎性細胞浸潤，說明DCM模型大鼠出現左心室的擴張，收縮功能降低，且心肌組織伴有炎癥損傷，符合以往DCM模型典型特征[7]，提示DCM模型復制成功。

中醫認為本病病機屬本虛標實，多以氣虛為本，血瘀、水濕為標[8]，故臨床多用益氣活血利水等方法[9]。抗纖益心方是河南省中醫院心病科臨床治療DCM的經驗方，研究表明其能有效的改善臨床患者的癥狀及心功能[10]，抗纖益心方中由黃芪、黨參、白術、茯苓、丹參等中藥組成，黃芪、黨參等益氣生血，茯苓健脾安神，白術補氣健脾，丹參活血化瘀，對于DCM氣虛下陷的癥狀有明顯改善[4]。王振濤[10-11]研究表明，抗纖益心方在改善擴張型心肌病患者癥狀有明確的療效。曾垂義等[12]的臨床觀察表明，抗纖益心方在改善擴張型心肌病患者心衰癥狀同時還能有效控制患者血壓。本研究結果顯示，與模型對照組比較，各抗纖益心方組大鼠射血分數升高、左室內徑及各室壁厚度降低、LVMI降低，提示抗纖益心方可有效改善DCM大鼠的心功能。

心室重構中基礎的病變是多種因素引起的心肌組織纖維化[13]，在諸多要素中，TGF-β作為在促纖維化過程中不可或缺的因子，依據靶細胞的不同，TGF-β對細胞增殖分化表現出促進或抑制的雙重作用[14]。現已明確，TGF-β與細胞外基質積淀有重要的聯系，在目前組織纖維化治療中常被選為作用靶點[15]，其在肺纖維化[16]、肝膽胰纖維化[17]、血管纖維化[18]、腎小管纖維化[19]等領域均有明確的研究證實其密切關系。與正常的心臟比較，TGF-β1在心肌纖維化進程中活性顯著上升。TGF-β1一旦被釋放，與細胞表面活性受體結合后經過一系列作用形成Smad2-Smad3-Smad4轉錄復合體，然后進入細胞核，這就是TGF-β/Smad信號傳導通路[20]。多項研究表明，TGF-β/Smads信號通路的作用在心肌纖維化里有著顯著意義[21-22]。齊靜等[23]發現心衰大鼠左心室TGF-β1及Smad3表達上調，提示可能與心肌纖維化有關。張娟娟[24]發現，高血壓左心室肥厚患者血清中TGF-β1明顯高于健康人，且血清中的濃度與高血壓進程正相關。李慶敏等[25]在對鐵皮石斛抑制心衰氣虛證大鼠心肌纖維化的研究中發現其作用可能與鐵皮石斛下調Gal-3、TGF-β、Smad3蛋白表達有關。孟慧等[26]認為，保元湯能通過調控TGF-β1來防治慢性心力衰竭。盡管已有多項研究表明，TGF-β1/Smads信號通路在心肌纖維化中發揮作用，但是在其發生發展過程中，此信號通路激活的時相性還不明確，該通路在心衰大鼠模型心肌纖維化的什么時間段開始被激活，在激活之后又能持續作用多長時間，這些對藥物的發揮效用有一定的作用。

本研究通過實驗發現觀察不同時間點DCM大鼠模型TGF-β1/Smads信號通路的表達，相關結果表明其在6周左右激活，8～10周進入高峰期，12周后進入平臺期，具有明確的時間節點。

本研究通過比較各組大鼠左心室TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7基因及蛋白表達發現，與模型對照組比較，小劑量抗纖益心方組無顯著性差異、大劑量抗纖益心方及貝那普利組有顯著性差異、聯合用藥組有非常顯著性差異。

以上研究結果明確了DCM大鼠心肌纖維化過程中，TGF-β1/Smads信號通路在6周左右激活，于8～10周達到高峰期，12周后達到平臺期。而中藥復方抗纖益心方能夠有效地抑制擴張型心肌病大鼠心肌纖維化進展，其作用機制與抑制心肌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1的表達，并進一步激活Smads信號通道，上調Smad7蛋白表達以及下調Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達有關。使用中藥復方抗纖益心方及時盡早地干預擴心病大鼠，能夠通過激活TGF-β/Smads信號通路充分有效地抑制DCM大鼠心肌纖維化進展，聯用ACEI制劑效果更佳。這也表明在擴張型心肌病患者的治療中抗纖益心方應當選擇合適的時間點及時介入。