阿卡波糖口服固體制劑含量測定方法的優(yōu)化

石笑弋，易必新*，李昌亮，2，李帥，2，劉雁鳴，2，蘭文，2，李健和（.湖南省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，長沙 4000；2.國家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料工程技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 4000；.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，長沙 400）

阿卡波糖是德國拜耳公司于20 世紀(jì)80年代從一種游離放線菌發(fā)酵分離得到的產(chǎn)物，由4 個(gè)單糖構(gòu)成的寡糖，是世界上第一個(gè)

α

-葡萄糖糖苷酶抑制劑類的口服降糖藥，主要用于2 型糖尿病的治療，可通過抑制淀粉酶來減少葡萄糖的吸收，更適合于降低以碳水化合物為主食的亞洲糖尿病患者的血糖。阿卡波糖口服固體制劑自1994年在中國批準(zhǔn)上市以來，不良反應(yīng)相對較小，市場占有率較高，應(yīng)用前景較廣。

目前，國內(nèi)現(xiàn)有阿卡波糖及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2020年版二部，其他相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)中阿卡波糖含量測定的分析方法多采用HPLC 法，檢測器普遍應(yīng)用紫外或示差折光檢測器，亦有利用電噴霧檢測器等新型檢測器檢測，色譜柱大多使用氨基柱，流動(dòng)相均采用大量有機(jī)試劑。現(xiàn)有方法大多存在受環(huán)境影響基線波動(dòng)較大、靈敏度降低、柱效下降快或普及率不高等問題。因此，對阿卡波糖片及膠囊的含量測定方法進(jìn)行改進(jìn)十分必要。本文采用SCX 色譜柱，優(yōu)化了阿卡波糖口服固體制劑中阿卡波糖含量測定的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

賽默飛Dionex UltiMate 3000 高效液相色譜儀、PDA 紫外檢測器；十萬分之一XP205 電子分析天平（Mettler Toledo）。阿卡波糖對照品（批號：100808-201905，含量：99.4%，中國食品藥品檢定研究院，水分：3.45%）。阿卡波糖原料藥（杭州中美華東制藥有限公司，批號：1909156AK）。1個(gè)廠家的阿卡波糖膠囊及6 個(gè)廠家的阿卡波糖片共165 批次樣品。磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸等試劑為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；純水（Thermo Scientific GenPure 超純水機(jī)制備）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Welch Ultimate XB-SCX 柱（4.6 mm×250 mm，3 μm），流動(dòng)相0.02 mol·L磷酸二氫鉀溶液，流速1.0 mL·min，柱溫40℃，檢測波長210 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 供試品溶液的配制 取本品20 片（或20粒內(nèi)容物），精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于阿卡波糖50 mg），置50 mL 量瓶中，加水適量，超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的配制 取阿卡波糖對照品適量，加水制成每1 mL 中約含1 mg 的溶液作為對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的配制 按處方比例及制備工藝，制備缺阿卡波糖的樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液的配制 取阿卡波糖原料藥約200 mg，置10 mL 量瓶中，加少量水使溶解，加0.1 mol·L氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，室溫放置1 h，加0.1 mol·L鹽酸溶液1 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下陰性樣品溶液、系統(tǒng)適用性溶液及供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣測定，結(jié)果主峰與相鄰雜質(zhì)峰均有效分離，以阿卡波糖色譜峰計(jì)，拖尾因子小于1.2，理論板數(shù)大于5000。溶劑、輔料對測定均無干擾，見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of system suitability test

2.4 線性范圍、檢測限與定量限

精密稱取阿卡波糖對照品215.19 mg，置50 mL 量瓶中，加水適量，超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液①，取該線性溶液6、3、2.5、2、0.5、0.2 mL，分別置10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為2.478、1.239、1.032、0.8260、0.2065、0.082 60 mg·mL的線性溶液②～⑦。進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（

X

）為橫坐標(biāo)和峰面積（

Y

）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得阿卡波糖回歸方程為

Y

＝2.529×10

X

－244.2，相關(guān)系數(shù)為1.000，線性范圍為0.082 60 ～4.130 mg·mL；并根據(jù)信噪比

S/N

≈ 3 確定檢測限（LOD），

S/N

≈ 10 確定定量限（LOQ），結(jié)果檢測限為6.8 μg·mL，定量限為22 μg·mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下質(zhì)量濃度約為1.0 mg·mL的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄保留時(shí)間與峰面積。結(jié)果阿卡波糖峰面積的

RSD

＜1.5%，保留時(shí)間的

RSD

均＜1.0%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（阿卡波糖片，批號：210301，規(guī)格：50 mg）6 份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備并測定，結(jié)果含量平均值為100.11%，

RSD

為0.70%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.5”項(xiàng)下溶液室溫避光放置，分別于0、2、4、8、12、16、20 及24 h 進(jìn)樣考察，阿卡波糖的峰面積

RSD

均＜2.0%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 回收試驗(yàn)

取陰性樣品，精密加入阿卡波糖對照品，制成濃度相當(dāng)于阿卡波糖含量100%水平的供試溶液共6 份，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算阿卡波糖的含量，結(jié)果平均回收率為99.41%，

RSD

為0.32%（

n

＝6）。

2.9 耐用性試驗(yàn)

通過調(diào)節(jié)流速及柱溫，考察阿卡波糖峰的變化情況。結(jié)果阿卡波糖峰的理論板數(shù)均大于5000，拖尾因子均小于1.2，與相鄰雜質(zhì)峰均能有效分離。

2.10 樣品測定

取165 批次樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，并將含量測定結(jié)果與《中國藥典》2020年版二部收載的采用氨基柱測定的結(jié)果進(jìn)行比較，采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件對兩種方法含量測定測結(jié)果進(jìn)行配對樣品

t

檢驗(yàn)。結(jié)果相關(guān)系數(shù)

r

＝0.542，

P

＜0.001，認(rèn)為兩配對變量有相關(guān)關(guān)系；

t

＝－3.263，

d

＝164，雙尾檢驗(yàn)概率

P

＝0.001，表明兩種檢驗(yàn)方法所測結(jié)果具有顯著性差異，結(jié)果見表1。

表1 樣品中阿卡波糖的含量結(jié)果( ＝165)
Tab 1 Content of acarbose in the sample ( ＝165)

含量均值的標(biāo)準(zhǔn)差/%藥典（采用NH2 色譜柱）98.811.12640.0877本文（采用SCX 色譜柱）99.091.21600.0946測定方法含量均值/%標(biāo)準(zhǔn)差/%

3 討論

《中國藥典》2020年版二部是采用HPLC 法測定阿卡波糖的含量。采用氨基色譜柱，以乙腈-磷酸鹽緩沖液（75∶25）為流動(dòng)相，流速2 mL·min，柱溫35℃，檢測波長 210 nm。該方法存在很多缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了方法的重現(xiàn)，并造成應(yīng)用困難：① 相鄰降解雜質(zhì)Ⅰ峰與主峰的分離效果不佳，只有系統(tǒng)適用性中規(guī)定雜質(zhì)Ⅰ的峰高（Hp）與雜質(zhì)Ⅰ和阿卡波糖兩峰之間的峰谷（Hv）之比Hp/Hv不得低于2.0 的要求；② 氨基柱耐用性較差，鍵合相容易流失，最多使用150 次左右，柱效嚴(yán)重降低，色譜峰峰形變差，影響準(zhǔn)確定量；③ 流動(dòng)相中有機(jī)試劑毒性大，流速大，檢測成本高。因此，有必要優(yōu)化阿卡波糖含量測定的分析方法，改善方法的重現(xiàn)性和可應(yīng)用性，提高藥品質(zhì)量控制水平。目前尚未見采用SCX 色譜柱HPLC 法測定阿卡波糖含量的報(bào)道。

3.1 流動(dòng)相的選擇

阿卡波糖在水中極易溶解，在乙腈中不溶。本文采用水為溶劑，0.02 mol·L磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相，能解決《中國藥典》2020年版二部方法中因溶劑與流動(dòng)相中有機(jī)相比例差異對靈敏度、出峰時(shí)間及峰形等的影響。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本文以0.02 mol·L磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min，柱溫40℃的色譜條件，采用SCX 色譜柱（4.6 mm×250 mm，3 μm），系統(tǒng)適用性要求均能達(dá)到。SCX 色譜柱是一種典型的陽離子交換柱，以磺酸基強(qiáng)陽離子硅膠為鍵合相，用于堿性、水溶的化合物的分離。SCX 色譜柱較氨基色譜柱的固定相穩(wěn)定，不易產(chǎn)生柱流失，在使用約300 次后，組分仍然能保持良好的峰形，對稱性好，拖尾因子小，分離度與理論板數(shù)能滿足系統(tǒng)適用性要求。

3.3 小結(jié)

本文采用SCX 色譜柱的HPLC 法測得的阿卡波糖口服固體制劑含量結(jié)果準(zhǔn)確、方法可靠，與《中國藥典》2020年版收載的方法相比，該方法毒性小、成本低、專屬性強(qiáng)、色譜柱耐用性好，具備一定的實(shí)用性。