CRITIC-AHP法結合Box-Behnken響應面法優選三金排石合劑提取工藝

石金敏，周燦，余緒明，鐘鑫昊，王佳，趙利軍*（.十堰市人民醫院（湖北醫藥學院附屬人民醫院）藥學部，湖北 十堰 442000；2.華中農業大學植物科學技術學院，武漢 40070；.湖北醫藥學院藥學院，湖北 十堰 442000）

三金排石合劑由石韋、金錢草、雞內金、瞿麥、川牛膝、烏藥、白芍、通草、海金沙和甘草等十味藥材配伍組成，諸藥合用，共奏清熱利濕、通淋排石、活血通經、祛瘀止痛之效。對于濕熱下注膀胱，煎熬尿液結為砂石，導致小便不利或中斷，尿血，腎結石，尿道炎等泌尿系疾病具有良好的治療效果，療效確切，應用廣泛，但未對其制備工藝進行系統的研究，本試驗以槲皮素、山柰酚和干膏得率等指標的含量進行CRITIC-AHP 法綜合評分，基于Box-Behnken 設計-響應面法得到三金排石合劑的提取工藝，以期為其深入研究及開發利用提供數據支持，保證臨床用藥的安全有效。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；KGD-15L 超聲波清洗儀（科廣達超聲設備有限公司）；CP214 電子分析天平（奧豪斯公司）。

1.2 試藥

石韋、金錢草等藥材均購自十堰市人民醫院，經藥學部雷龍副主任中藥師鑒定均符合《中國藥典》2020年版相關規定。

對照品山柰酚（批號：110861-202013，含量93.2%）、槲皮素（批號：100081-201610，含量99.1%）（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；無水乙醇、鹽酸、磷酸（分析純，武漢市中天化工有限責任公司）；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 樣品制備

精密稱量三金排石合劑方中對應的中藥飲片共40.3 g，選取1000 mL 圓底燒瓶，將藥材分別加入燒瓶中，按照響應面法設計條件進行回流提取，收集每一次的提取液并濃縮至100 mL 以下，用水定容至100 mL 量瓶中。

2.2 色譜條件

色譜柱：WondaSiL C-WR 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相： 甲醇-0.4%磷酸水（43∶57）；流速：1.00 mL·min；檢測波長：360 nm；柱溫：40℃；進樣量：10 μL。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取槲皮素、山柰酚對照品適量，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質量濃度分別為7 μg·mL、10 μg·mL的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

精密吸取樣品10 mL，置于100 mL 錐形瓶中，精密加入40 mL 甲醇和6 mL 鹽酸，稱重，90℃水浴回流提取1 h，迅速冷卻，加80%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，過濾，即得供試品溶液。

2.5 方法學考察

2.5.1 系統適應性試驗 取“2.3”項下對照品溶液，“2.4”項下供試品溶液，空白溶液（精密吸取純凈水10 mL，同“2.4”項下方法制備），進樣檢測，色譜圖見圖1。

圖1 三金排石合劑HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of Sanjin Paishi mixture

2.5.2 線性關系考察 分別精密稱取槲皮素、山柰酚對照品適量，用甲醇稀釋成質量濃度槲皮素為28、14、7、3.5、1.8、0.9 μg·mL和山柰酚為42、21、11、5.5、2.8、1.4 μg·mL的混合對照品溶液，進樣測定，以各成分的峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，槲皮素、山柰酚線性回歸方程分別為

Y

＝4×10

X

－3783.5（

r

＝1.0000），

Y

＝4.8×10

X

－1.41×10（

r

＝0.9998），線性范圍分別為0.9 ～28 μg·mL和1.4 ～42 μg·mL。2.5.3 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，連續進樣6 次，結果槲皮素、山柰酚峰面積的

RSD

值分別為2.1%、1.3%，結果表明儀器精密度較好。2.5.4 重復性試驗 取“2.4”項下供試品溶液6 份，進樣測定，計算得槲皮素、山柰酚峰面積的

RSD

值分別為3.5%、3.5%，表明該方法的重復性較好。2.5.5 穩定性試驗 取“2.4”項下同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h 進樣測定，結果槲皮素、山柰酚峰面積的

RSD

值分別為2.0%、1.5%，表明供試品溶液在12 h 內穩定。2.5.6 加樣回收試驗 分別精密量取“2.1”項下已知含量的樣品5 mL 6 份，分別加入0.02 mg·mL槲皮素對照品溶液和0.035 mg·mL山柰酚對照品溶液適量，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，進樣檢測，計算槲皮素、山柰酚平均加樣回收率分別為98.6%和100.1%，

RSD

依次為2.6%和4.0%，結果表明該方法準確度良好。

2.6 干膏得率測定[2]

精密量取“2.1”項下樣品溶液25 mL，置于已干燥至恒重的陶瓷蒸發皿中，水浴蒸干，再置于恒溫鼓風干燥箱內105 ℃恒溫干燥3 h，冷卻至室溫，迅速稱定重量，計算干膏得率。

2.7 綜合評分

2.7.1 CRITIC 法計算權重 將方差分析的試驗數據經過線性插值處理，即[指標成分值＝（實測值－最小值）／（最大值－最小值）]，消除單位量綱后，計算各指標對比強度（

s

）、沖突性（

δ

）、綜合權重（

c

）與權重（

ω

），結果見表1。由表1 可知，槲皮素、山柰酚、干膏得率經CRITIC 法計算得到的客觀權重分別為0.2504、0.2460、0.5036。

表1 CRITIC 法各指標數值
Tab 1 Index values of CRITIC method

考察指標槲皮素山柰酚干膏得率si23.733423.362327.8561 δi 0.5340 0.5330 0.9150 ci12.673612.452125.4883 ωi 0.2504 0.2460 0.5036

2.7.2 AHP 法計算權重 根據方中各成分的藥理作用強弱和君臣佐使配伍規律，將干膏得率和指標性成分的重要性作為權重指標予以指標量化，構建成對比較的判斷優先矩陣，各指標的優先順序：槲皮素＝山柰酚＞干膏得率，賦予各項指標的相對評分，經層次分析后的結果見表2。

表2 指標成對比較優先判斷矩陣
Tab 2 Priority judgment matrix for paired comparison of indicators

指標成分槲皮素山柰酚干膏得率槲皮素114山柰酚114干膏得率1/41/41

根據表2 評分結果，計算得到槲皮素、山柰酚、干膏得率的權重系數分別為0.4444、0.4444、0.1111。一致性比例分子（CR）＜0.1，即指標優先比較矩陣通過一致性檢驗，權重系數有效。

2.7.3 CRITIC-AHP 通過CRITIC 法和AHP 法分別計算得到三金排石合劑中槲皮素、山柰酚及干膏得率的相關權重，復合權重（

ω

）＝

ω

ω

/∑

ω

ω

，按公式計算得槲皮素、山柰酚及干膏得率復合權重分別為0.4023、0.3953、0.2023。

2.8 Box-behnken 響應面法優化提取工藝

2.8.1 單因素試驗 參考文獻進行相關的預試驗，根據結果選定加水量（A）、提取時間（B）、提取次數（C）等連續變量作為影響因素進行單因素試驗，由單因素試驗的結果設計響應面試驗各因素的水平范圍，因素水平見表3。

表3 響應面試驗因素與水平
Tab 3 Factor and level of response surface methodology

因素水平－101 A 加水量/倍81012 B 提取時間/h0.511.5 C 提取次數/次123

2.8.2 響應面試驗設計及結果 由綜合評價指標對水提取工藝的影響，結合各項指標對其進行運算，確定綜合評分（

Y

）＝[（槲皮素含量/槲皮素最大含量）×0.4023 ＋（山柰酚含量/山柰酚最大含量）×0.3953 ＋（干膏率含量/干膏率最大含量）×0.2023]×100。

根據響應面的組合設計原理，采用Design Expert 8.0.6 軟件，選擇Box-Behnken 擬合模型，設置5 個中心試驗點，以3 個指標總含量的綜合評分為響應值，設計出17 個試驗點的試驗方案，對加水量、提取時間、提取次數進行研究，結果見表4。

表4 響應面試驗設計及結果
Tab 4 Design and results of response surface methodology

試驗號A.加水量B.提取時間C.提取次數槲皮素/（mg·g－1）山柰酚/（mg·g－1）干膏得率/%綜合評分1－1010.032 330.056 0623.911776.4847 2 1 1 0 0.031 000.052 4822.366372.2465 3－100.040 220.058 4321.526689.9235 4 1 0－10.030 160.050 0715.743965.0890 1 5－1100.030 130.053 4020.385170.3987 6 0 0 0 0.037 680.058 8221.838281.0887 7－10－10.024 850.042 4213.076954.3207 8 1 0 1 0.032 870.050 6423.928574.1956 0.038 440.066 8525.968289.1208 10－1－100.038 220.063 7919.282482.1411 110－1－10.031 880.054 3513.628867.1908 1201－10.032 310.050 6415.246766.9264 130－110.044 850.076 7922.017996.9135 140000.035 170.060 4421.938579.7510 150000.035 940.057 4020.783177.9732 160000.040 340.067 6121.413487.6696 170000.037 290.065 0021.577283.7178 9 0 1 1

2.8.3 試驗結果分析 采用Design Expert 8.0.6對17 個試驗點對應的數據進行方差分析，結果見表5，其中

P

＜0.05 為顯著項，

P

＜0.01 為極顯著項，同時得到三因素與綜合評分的三元二次方程：

Y

＝82.04 ＋2.26

A

－4.68

B

＋10.40

C

－1.48

AB

－3.26

AC

－1.88

BC

－7.94

A

＋4.58

B

－6.58

C

。

表5 方差分析
Tab 5 Analysis of variance

來源平方和 自由度均方F 值P 值模型1679.429186.607.790.0065 A 40.99140.991.710.2321 B 175.561175.567.330.0303 C 865.021865.0236.110.0005 AB8.8018.800.370.5635 AC42.62142.621.780.2240 BC14.17114.170.590.4670 A2265.381265.3811.080.0126 B288.18188.183.680.0965 C2182.221182.227.610.0282殘差167.68723.35失擬項110.49336.832.580.1915誤差57.19414.30總和1847.1116

該模型顯著性檢驗

P

＝0.0065 ＜0.05，模型表現為顯著，二次多項式回歸模型具有顯著性意義；模型的失擬項

P

＝0.1915 ＞0.05，提示模型與實測數據擬合度好，模型值的運算可替代實際試驗值對結果進行預測分析；提取工藝考察的3個因素通過分析相應

P

值可知，各因素影響大小依次為：C ＞B ＞A，即對三金排石合劑中所含的各項指標及綜合評分影響最大的是提取次數，其次是提取時間和加水量。另外，模型的決定性系數

R

＝0.9092，表明該模型可解釋3 個因素90.92%的變異性，校正決定系數

R

A＝0.7925，說明該模型擬合程度良好，且能解釋79.25%響應值的變化，即模型可用于對三金排石合劑的綜合評分及各項指標的預測。

根據分析結果繪制響應面3D 圖，對加水量、提取時間、提取次數這三個因素每兩兩之間的交互作用強弱進行比較，結果見圖2。

圖2 加水量（A）、提取時間（B）和提取次數（C）交互作用的三維響應面圖Fig 2 3D response surface of water adding amount（A），extraction time（B）and extraction times（C）

從三個交互因素形成的曲面陡峭程度可以看出，提取次數與加水量的交互影響最大，影響綜合評分的主次順序為提取次數＞加水量＞提取時間，以上分析與表5 中方差分析的結果吻合。

采用Design Expert 8.0.6 預測最佳提取工藝參數：加水量為10.09、提取時間為0.5 h、提取次數為2.92 次。綜合實際操作的便利性，調整為：加水量為10 倍量、提取時間為0.5 h、提取次數為3 次，在此條件下模型預測的綜合評分為97.05。

2.9 驗證試驗

按照優化條件進行3 次平行試驗，實際測得綜合評分均值為97.50，與預測值相比相對誤差小于5%，表明，本試驗建立的回歸模型適用于三金排石合劑中各種指標的綜合評分的預測，與實際測定數值擬合度較好，優化得到的提取工藝參數準確可靠，結果見表6。

表6 驗證結果
Tab 6 Verification test

編號槲皮素/（mg·g－1）山柰酚/（mg·g－1）干膏得率/%綜合評分10.041 150.070 1720.772299.3521 20.039 960.068 3621.450196.6734 30.041 010.067 2920.754396.4611

3 討論

3.1 鹽酸加入量對槲皮素、山柰酚含量的影響

對供試品溶液制備方法中鹽酸加入量（5、6、7、8、9、10、11 mL）進行考察，結果顯示，槲皮素、山柰酚的含量呈現先增加再遞減的趨勢，當鹽酸加入量為6 mL 時兩者含量達到最大，因此，最終確定其加入量為6 mL。

3.2 權重方法的選取

本試驗采用CRITIC-AHP 復合加權法計算權重。CRITIC 法是從實際數據出發，利用指標值所反映的客觀信息確定權重的一種方法，此法容易忽視指標間的輕重關系。AHP 法是基于研究者的經驗，人為確定各項指標的重要性進行比較而賦權的方法，能切合實際考慮試驗中各指標的優選順序，但主觀性較強，易受影響，結果不具有普遍性。AHP-CRITIC 法復合加權法共具兩種方法的優點，主客觀并重，其結果具有穩定性和可靠性，且能區分數據信息。

3.3 Box-Behnken 響應面法

本研究采用Box-Behnken 響應面法對三金排石合劑的提取工藝進行了研究，通過多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，能夠準確表示試驗設計與優化結果，與正交試驗相比準確度更高、可預測性更強。該模型預測最佳工藝為加入加水量為10倍量水、提取時間為0.5 h、提取次數為3 次。驗證試驗結果與預測值相比，誤差小于5%，說明利用Box-Behnken 響應面法結合AHP 法優化三金排石合劑的提取工藝，方法科學、合理可行、穩定可靠，為進一步開發中藥治療泌尿系結石提供參考依據。