基于網絡藥理學的復方杜仲健骨顆粒作用機制解析研究

舒展，任越，陳紫軍，張燕玲（北京中醫藥大學中藥學院 國家中醫藥管理局中藥信息工程重點實驗室，北京 102488）

復方杜仲健骨顆粒由杜仲、白芍、續斷、黃芪、枸杞子、牛膝、三七、雞血藤、人參、當歸、黃柏、威靈仙12 味中藥組成。該藥為紅棕色的顆粒，微苦，具有滋補肝腎、養血榮筋、通絡止痛的功效，臨床上主要用于膝關節骨性關節炎、缺血性股骨頭壞死等骨關節疾病的治療。方中君藥為杜仲，可補肝腎、強筋骨。黃芪、續斷、白芍為臣藥，具有養血榮筋、補氣固表、柔肝止痛、調血脈、解痙抗炎、免疫調節的作用。人參、牛膝、當歸、枸杞子、黃柏、三七、雞血藤為佐藥，具有補肝腎、益精氣、堅筋骨、消腫定痛的作用。威靈仙作為佐藥，發揮祛風濕、通經絡、止痛的功效。現代藥理學研究證實，復方杜仲健骨顆粒可以有效改善骨關節疾病，其提取液能直接作用于軟骨細胞，改善新陳代謝，進而維護關節軟骨的正常構造和功能，防止骨關節炎疾病的進一步發展。

然而復方杜仲健骨顆粒的組成中藥眾多，且化學成分復雜，其發揮作用的具體機制尚不清楚。網絡藥理學的研究思路與中醫藥多成分、多靶標、系統調控的理念相一致，將其應用于中藥研究能夠明確藥效物質和疾病的關系，揭示藥物的作用機制，具有獨到的優勢和廣闊的前景。因此，本研究通過數據庫收集復方杜仲健骨顆粒的化學成分及其潛在作用靶標，分析其生物功能及信號通路，以期從分子網絡水平上研究復方杜仲健骨顆粒整體的作用機制，并對部分藥理作用和關鍵靶標進行生物驗證，進而評價網絡藥理學分析方法的合理性和準確性。

1 材料與方法

1.1 基于網絡藥理學的復方杜仲健骨顆粒作用機制研究

1.1.1 復方杜仲健骨顆粒中藥成分及靶標篩選及收集 通過中藥化學成分數據庫（Traditional Chinese Medicine Database，TCMD）和中藥系統藥理學數據庫TCMSP（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）收集復方杜仲健骨顆粒12 味中藥的化學成分，并通過TCMSP 數據庫收集相應成分的靶標。

1.1.2 靶標名稱校準 采用UniProt（https：//www.uniprot.org/）數據庫中UniProtKB 檢索功能，通過輸入“1.1.1”項下收集到的蛋白名稱，規定物種為“human”，將獲得的所有蛋白校正為UniProt ID，從而得到復方杜仲健骨顆粒的化合物潛在作用靶標。

1.1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡的構建及關鍵靶標的獲取 為明確復方杜仲健骨顆粒靶標間的相互作用，將復方杜仲健骨顆粒潛在作用靶標導入STRING（https：//string-db.org/）平臺構建蛋白相互作用網絡（protein-protein interaction network，PPI），選擇置信度高于0.7 的蛋白互作信息，然后將PPI 網絡模型導入Cytoscape 3.8.2軟件，利用cytoHubba 插件，計算互作網絡中節點的度值（degree），并用度值評價節點在網絡中的關鍵程度。

1.1.4 GO 功能富集分析與KEGG 富集分析 通過DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對得到的化合物潛在作用靶標開展GO 富集分析和KEGG 富集分析。以

P

＜0.05 作為篩選條件，獲取復方杜仲健骨顆粒可能作用的GO 富集結果及信號通路。

1.2 復方杜仲健骨顆粒部分藥理作用及關鍵靶標的驗證

1.2.1 細胞 小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7，購于上海澤葉生物科技有限公司。

1.2.2 儀器與試藥 二氧化碳培養箱（美國賽默飛公司）；倒置相差顯微鏡（德國徠卡公司）；TDL-50B 低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；冷凍干燥機（北京博醫康技術有限責任公司）。復方杜仲健骨顆粒（批號：2010908，規格每袋12 g，北京雙鶴藥業銷售有限責任公司）；DMEM 高糖培養基（含谷氨酰胺，含丙酮酸鈉，貨號：06-1055-57-1ACS）、熱滅活特級胎牛血清（貨號：04-121-1A，BI 公司）；青鏈霉素（貨號：15140122，Invitrogen 公司）；MTT（貨號：0793，AMRESCO 公司）；脂多糖（LPS，貨號：L2880，LABLEAD 公司）；一氧化氮檢測試劑盒（貨號：E1030，北京普利萊基因技術有限公司）；無水乙醇（貨號：SJ-C1-13-01ZY-017，天津市致遠化學試劑有限公司）；氯仿（貨號：112050，北京市通廣精細化工公司）；異丙醇（貨號：10239，美國賽默飛公司）；無DNA酶/RNA 酶去離子水（貨號：RT121）、6×Loading Buffer（貨號：9156）、D2000 分子量標準（貨號：MD114-02）、GeneGreen 核酸染料（貨號：RT210）（TIANGEN 公司）；PCR 引物（上海生工公司）；PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）（貨號：RR037A）、SYBR Premix Ex Taq II（貨號：RR820A）（TAKARA 公司）。

1.2.3 藥物配制 稱取復方杜仲健骨顆粒10 g 加蒸餾水50 mL，超聲破碎90 min（20 kHz），5000 r·min離心15 min。離心后取上清液，利用冷凍干燥機將上清凍干后于－20℃保存，實驗前用DMEM 培養液稀釋，5000 r·min離心15 min，兩次離心后，0.22 μm 濾膜過濾，依次稀釋至質量濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 g·L。

1.2.4 細胞培養及傳代 RAW 264.7 細胞培養于含10%熱滅活特級胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 高糖培養基，于37℃、5%CO條件下培養，次日更換新鮮DMEM 完全培養基。

1.2.5 復方杜仲健骨顆粒細胞毒性評價 RAW 264.7 細胞生長至85%～90%時，制成密度為每孔5×10個的細胞懸液，接種于96 孔板中培養。培養箱孵育24 h 后棄去培養基，每孔加入100 μL 含有不同質量濃度的藥物培養基（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 g·L），每組設置4 個復孔，置5% CO、37℃的培養箱中培養24 h 后，每孔加入MTT 溶液（5 mg·mL）100 μL，培養箱內避光孵育4 h 后棄去上清液，每孔加入DMSO 150μL，避光振搖10 min，采用連續光譜掃描式酶標儀在490 nm 波長處測量各孔的吸光度值，并計算各組細胞的存活率。

1.2.6 復方杜仲健骨顆粒對NO 釋放的影響RAW 264.7 細胞生長至85%～90%時進行細胞傳代，制成密度為每孔5×10個的細胞懸液，接種于96 孔板中培養。培養箱孵育24 h 后，棄去舊的培養液，將96 孔板培養的細胞分為空白對照組、模型組和不同劑量藥物組。空白對照組加入完全培養基；模型組加入0.2 μg·LLPS 溶液；藥物組加入0.2 μg·LLPS 和不同質量濃度的復方杜仲健骨顆粒（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 g·L）混合液。作用24 h 后，采用NO 檢測試劑盒測定NO 釋放量。

1.2.7 復方杜仲健骨顆粒對

TNF

、

STAT3

、

MAPK1

mRNA 表達的影響 將處于對數期的RAW 264.7細胞以每孔9×10個接種于6 孔板中，每孔2 mL。細胞貼壁24 h 后，設為空白對照組、模型組和藥物組，空白對照組加入完全培養基；模型組加入0.2 μg·LLPS 溶液；藥物組加入0.2 μg·LLPS 和最大無毒濃度的復方杜仲健骨顆粒混合液，每孔2 mL，培養24 h 后，提取總RNA。使用RNA 逆轉錄試劑盒進行反轉錄。RT-qPCR 采用SYBR Green 法。利用2計算目的基因表達量，試驗所需引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。目的基因引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列
Tab 1 Primer sequence of PCR

靶標正向引物反向引物STAT3AATCTCAACTTCAGACCCGCCAACGCTCCACGATCCTCTCCTCCAG TNFGCGACGTGGAACTGGCAGAAGGTGGTTTGTGAGTGTGAGGGTCTG MAPK1AATAAGGTGCCGTGGAACAGGTTGAAGTCGTCCAGCTCCATGTCAAAC GAPDH（內參）CGTCCCGTAGACAAAATGGTTTGATGGCAACAATCTCCAC

1.2.8 統計學方法 使用GraphPad Prism 5 軟件對數據進行處理和統計學分析，組間比較使用單因素方差分析方法（One-way ANOVA），

P

＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基于網絡藥理學的復方杜仲健骨顆粒作用機制研究

2.1.1 復方杜仲健骨顆粒中藥成分及靶標篩選及收集 本研究基于TCMSP 數據庫、TCMD 數據庫，收集得到復方杜仲健骨顆粒化學成分及對應靶標。去重后得到杜仲相關成分167 個，續斷57個，黃芪115 個，三七191 個，黃柏153 個，威靈仙81 個，枸杞102 個，人參326 個，當歸161個，白芍112 個，牛膝56 個，雞血藤71 個。通過TCMSP 收集到337 個靶標蛋白，經UniProt數據庫對靶標名稱進行校準后去重，共得到有效UniProtID 279 個。

2.1.2 復方杜仲健骨顆粒蛋白互作網絡構建與關鍵靶標的篩選 將279 個潛在靶標錄入STRING數據庫， 設置interaction score ＞0.7， 利用Cytoscape 3.8.2 進行可視化分析，構建PPI 網絡，見圖1。對復方杜仲健骨顆粒PPI 的關鍵靶標進行分析發現，可參與抗炎作用，如TNF、IL-6 等；并可參與細胞生長、增殖和分化，如STAT3、VEGFA 等；部分靶標對細胞信號轉導具有調節作用，如MAPK1、MAPK14、MAPK8 等。

圖1 復方杜仲健骨顆粒蛋白-蛋白互作網絡圖Fig 1 PPI network of compound Duzhong Jiangu granule

2.1.3 GO 富集分析結果 以

P

＜0.05 為篩選條件，獲得GO 功能富集條目678 個，其中生物過程條目487 條。對以上生物過程進行分析，發現復方杜仲健骨顆粒可能參與的生物學過程可以歸為調節炎癥反應，對細胞增殖、分化、凋亡的調控，影響血管生成等方面（見表2）。

表2 復方杜仲健骨顆粒作用靶標GO 生物學過程富集
Tab 2 Biological process of GO target enrichment in compound Duzhong Jiangu granule

分類條目名稱P 值炎癥反應細胞對脂多糖的反應（cellular response to lipopolysaccharide）4.39×10－12脂多糖介導的信號通路（lipopolysaccharide-mediated signaling pathway）1.55×10－9對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）8.73×10－8炎癥反應（inflammatory response）1.73×10－5 NF-κB 轉錄因子活性的正調節（positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity）6.99×10－5 I-κB 激酶/NF-κB 信號的正調節（positive regulation of I-kappaB kinase/NF-kappaB signaling）3.36×10－4細胞因子分泌的正向調節（positive regulation of cytokine secretion）6.88×10－4白三烯生物合成過程（leukotriene biosynthetic process）4.07×10－3對細胞增殖、分化、凋亡的調控凋亡過程的負調控（negative regulation of apoptotic process）1.01×10－10凋亡過程的正向調控（positive regulation of apoptotic process）2.64×10－8無配體的外在凋亡信號通路（extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand）6.03×10－8神經元凋亡過程的負調控（negative regulation of neuron apoptotic process）1.85×10－6神經元凋亡過程的正向調節（positive regulation of neuron apoptotic process）5.83×10－6參與凋亡過程的半胱氨酸型內肽酶活性的激活（activation of cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process）8.73×10－6凋亡過程（apoptotic process）2.32×10－5神經元凋亡過程（neuron apoptotic process）1.88×10－4內在凋亡信號通路的負調控（negative regulation of intrinsic apoptotic signaling pathway）4.14×10－4響應DNA 損傷的內在凋亡信號通路（intrinsic apoptotic signaling pathway in response to DNA damage） 1.01×10－3響應內質網應激的內在凋亡信號通路（intrinsic apoptotic signaling pathway in response to endoplasmic reticulum stress）1.67×10－2通過死亡域受體的外在凋亡信號通路（extrinsic apoptotic signaling pathway via death domain receptors） 2.43×10－2腫瘤壞死因子產生的負調控（negative regulation of tumor necrosis factor production）2.43×10－2血管生成血管生成的正向調節（positive regulation of angiogenesis）5.29×10－8血管生成（angiogenesis）8.50×10－5血管內皮生長因子受體信號通路（vascular endothelial growth factor receptor signaling pathway）1.78×10－4血管生成的調節（positive regulation of angiogenesis）4.07×10－3

2.1.4 KEGG 富集分析結果 以

P

＜0.05 為篩選條件，對279 個靶蛋白進行KEGG 通路富集，共富集到133 條信號通路。對以上信號通路進行分析、歸類，發現復方杜仲健骨顆粒主要影響炎癥、軟骨細胞增殖、分化、凋亡以及代謝等相關通路過程發揮作用，結果見表3。

表3 復方杜仲健骨顆粒作用靶標KEGG 通路富集
Tab 3 KEGG signal pathway information of compound Duzhong Jiangu granule

分類信號通路名稱P 值炎癥相關信號通路腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）4.66×10－9 HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）3.25×10－8 Toll 樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）1.48×10－7 T 細胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway）4.65×10－5軟骨細胞增殖、分化及凋亡相關通路鈣信號通路（calcium signaling pathway）6.63×10－8 p53 信號通路（p53 signaling pathway）1.98×10－5 PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）3.07×10－5 FoxO 信號通路（FoxO signaling pathway）7.24×10－5 MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）2.30×10－4 NF-κB 信號通路（NF-kappa B signaling pathway）2.30×10－4 Rap1 信號通路（Rap1 signaling pathway）1.21×10－3催產素信號通路（oxytocin signaling pathway）6.84×10－3 Jak-STAT 信號通路（Jak-STAT signaling pathway）1.37×10－2間接相關通路HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）3.25×10－8雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）3.12×10－7甲狀腺激素信號通路（thyroid hormone signaling pathway）4.97×10－7血管內皮生長因子信號通路（VEGF signaling pathway）1.13×10－6胰島素抵抗信號通路（insulin resistance signaling pathway）5.29×10－6脂肪細胞因子信號通路（adipocytokine signaling pathway）1.60×10－4

2.2 復方杜仲健骨顆粒部分藥理作用及關鍵靶標驗證

為了進一步評價網絡藥理學結果的可靠性，研究對網絡藥理學獲得的關鍵藥理作用及靶標進行了實驗驗證。炎癥是骨關節疾病中非常重要的致病機制，且在本研究中為關鍵藥理作用。因此本研究選擇抗炎活性進行驗證。LPS 刺激誘導的RAW 264.7 細胞炎癥模型可較好地反映體內局部炎癥狀態，NO 水平能夠反映炎癥的嚴重程度。因此研究通過檢測復方杜仲健骨顆粒對LPS 刺激誘導的RAW 264.7 細胞炎癥模型的NO 生成抑制作用進而評價其抗炎活性。此外，基于拓撲分析發現TNF、STAT3、MAPK1 是復方杜仲健骨顆粒的關鍵作用靶標。故研究利用RT-qPCR 對其進行驗證。

2.2.1 復方杜仲健骨顆粒細胞毒性研究 不同濃度的復方杜仲健骨顆粒對RAW 264.7 細胞活性的影響結果見圖2。結果顯示，0.3125 ～2.5 g·L復方杜仲健骨顆粒對細胞無毒性，表明在2.5 g·L以下，復方杜仲健骨顆粒對RAW 264.7 細胞的正常生長無影響。

圖2 復方杜仲健骨顆粒對RAW 264.7 細胞存活率的影響Fig 2 Effect of compound Duzhong Jiangu granule on the survival rate of RAW 264.7 cells

2.2.2 復方杜仲健骨顆粒抗炎活性研究 與空白對照組相比，模型組NO 釋放量明顯增加（

P

＜0.001）。結果提示LPS 能誘導炎癥的發生，成功構建了巨噬細胞炎癥模型。與模型組相比，復方杜仲健骨顆粒在0.3125 ～2.5 g·L能有效降低NO 的釋放（

P

＜0.001），見表4。表明復方杜仲健骨顆粒可以在一定程度上恢復RAW 264.7 的炎性損傷，進一步驗證了復方杜仲健骨顆粒的抗炎作用。

表4 復方杜仲健骨顆粒對LPS 誘導的小鼠巨噬細胞釋放NO 的抑制作用
Tab 4 Inhibitory effect of compound Duzhong Jiangu granule on NO release induced by LPS

注：與空白對照組比較， ＜0.001；與模型組比較， ＜0.001。
Note：Compared with the blank control group， ＜0.001；compared with the model group， ＜0.001.

組別NO 釋放量/（μmol·L－1）抑制率/%空白對照組 1.04±0.05—模型組37.74±0.72*—復方杜仲健骨顆粒0.3125 g·L－1 組 34.42±0.21# 9.03±0.02復方杜仲健骨顆粒0.625 g·L－1 組29.87±0.22#21.43±0.02復方杜仲健骨顆粒1.25 g·L－1 組26.59±0.28#30.38±0.02復方杜仲健骨顆粒2.5 g·L－1 組 7.71±0.15#81.83±0.01

2.2.3 復方杜仲健骨顆粒對

TNF

、

STAT3

、

MAPK1

mRNA 表達的影響 結果顯示，與空白對照組相比，模型組

TNF

、

STAT3

、

MAPK1

的mRNA 表達水平上調（

P

＜0.01）；與模型組相比，2.5 g·L的復方杜仲健骨顆粒可使

TNF

、

STAT3

、

MAPK1

的mRNA 表達水平降低（

P

＜0.05，

P

＜0.01 或

P

＜0.001），見圖3。

圖3 TNF、AKT1 和MAPK1 mRNA 表達水平Fig 3 mRNA expression level of TNF，AKT1，and MAPK1

3 討論

復方杜仲健骨顆粒在臨床上應用廣泛，然而其整體作用機制尚不明確。本研究利用網絡藥理學結合體外實驗，初步探討了復方杜仲健骨顆粒的整體作用機制。

綜合拓撲參數、KEGG、GO 富集分析所得到的關鍵靶標、信號通路、生命過程，構建復方杜仲健骨顆粒“關鍵靶標-信號通路-生命過程-藥理作用”網絡，見圖4。分析網絡藥理學結果發現，復方杜仲健骨顆粒具有調節炎癥反應、調控細胞增殖、分化及凋亡、影響血管生成等藥理作用。

圖4 “關鍵靶標-信號通路-生命過程-藥理作用”網絡Fig 4 Network of key targets-signaling pathways-biological processes-pharmacological action

目前，復方杜仲健骨顆粒在臨床上可用于骨關節疾病的治療。現代醫學研究發現，骨關節疾病的根本原因在于軟骨等“關節保護系統”對關節保護能力的喪失。研究表明，軟骨細胞和關節組織的其他細胞分泌的促炎因子能夠促進軟骨基質的降解，進而破壞關節組織代謝平衡并導致骨關節疾病的產生。此外，軟骨細胞增殖、分化以及凋亡過程能夠影響關節軟骨的退化。研究發現，在軟骨病變的過程中，血管侵襲作為軟骨破壞的始動環節，起到了不容忽視的作用，新生血管可進一步加重軟骨結構的破壞，抑制血管侵襲可以阻止骨關節炎的進一步發展。故推測復方杜仲健骨顆粒可能是通過影響骨關節處炎癥、軟骨細胞增殖、分化以及凋亡及調節血管生成等藥理作用，進而發揮治療骨關節疾病的作用。

為評價網絡藥理學方法的合理性和準確性，進一步進行了實驗驗證。首先針對作用突出的抗炎活性進行了體外實驗驗證。本研究采用LPS 刺激巨噬細胞模擬人體在某些因素的刺激下引起的炎癥反應的發生，通過不同濃度梯度的復方杜仲健骨顆粒對LPS 誘導的RAW 264.7 的炎性損傷進行細胞實驗。結果表明復方杜仲健骨顆粒可在一定程度上減輕RAW 264.7 的炎癥反應，進一步驗證了其抗炎作用。

對網絡藥理學篩選出的部分核心靶標進行RT-qPCR 檢測，發現復方杜仲健骨顆粒能夠抑制LPS 誘導的RAW 264.7 炎癥細胞中

TNF

、

STAT3

和

MAPK1

基因的表達，與PPI 分析結果吻合。在骨關節炎疾病患者中，炎癥相關靶標TNF 異常高表達。STAT3 是一種關鍵調節因子，在炎性反應中發揮著重要的作用。且研究發現，STAT3是骨關節疾病的的核心轉錄因子，其可通過核因子

κ

B（NF-

κ

B）信號進一步導致骨關節疾病的發生。MAPK1 是MAPK 信號轉導通路的重要組成部分，MAPK 信號轉導通路則能夠負責調節產生促炎細胞因子的過程，該過程最終可導致關節發炎和破壞，由此推斷復方杜仲健骨顆粒可能通過抑制

TNF

、

STAT3

和

MAPK1

mRNA 表達發揮抗炎的作用。上述結果在一定程度上從藥效以及靶標層面揭示了復方杜仲健骨顆粒發揮作用的分子機制，并佐證了網絡藥理學結果。

綜上所述，本研究為復方杜仲健骨顆粒的整體作用機制解析提供了參考，為其臨床應用提供了一定基礎。然而本研究仍存在一定不足，首先，本研究聚焦整體作用機制，未聚焦特定疾病，后期可針對特定疾病展開進一步研究。此外，研究僅對復方杜仲健骨顆粒抗炎活性以及部分關鍵靶標進行了體外驗證，未對其他活性和靶標進行體外及體內驗證。研究下一步將通過體外或體內實驗對復方杜仲健骨顆粒的其他活性和關鍵靶標進行進一步驗證，為其臨床應用提供指導。