聯合質譜法與光譜法探討輻照前后醫用膠原蛋白海綿的三螺旋結構及變化

程紅，田銳（.華中科技大學分析測試中心，武漢 430074；.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，武漢 430030）

膠原蛋白是哺乳動物體內最豐富的蛋白質，是細胞外基質中的主要結構蛋白，廣泛存在于皮膚、骨骼、肌腱、韌帶和其他結締組織中，主要用于止血海綿、軟組織增強注射物、細胞產品基質以及藥物輸送的載體。其中，膠原蛋白海綿具有吸收組織滲出物、透氣性好、促進上皮細胞生長和肉芽組織生成等優良特性，可應用于止血和創面愈合。手術創傷引起不同程度的出血和滲血直接影響手術的治療效果。手術中采用物理、機械或化學的止血方法均存在一定的局限性和不良反應，而膠原蛋白類的止血敷料則是一種有益的補充，如在膽囊切除手術、T 管引流手術、闌尾切除手術、胃大部切除手術、肝葉切除手術、胰十二指腸切除術、左半或右半結腸切除手術（切除后端-端吻合）、脾臟切除等相關手術中均能獲得穩定而滿意的止血效果。在大多數的手術操作中，在切除的斷端或出血的局部，應用1 ～2 片膠原蛋白海綿短暫壓迫即可達到止血的目的。

膠原蛋白和膠原蛋白海綿的共同特點是三螺旋結構：三條

α

多肽鏈形成超螺旋構象，出現頻率最高的氨基酸序列是-Gly-Y-Z，其中甘氨酸（Gly）代表每隔兩個氨基酸就出現的重復殘基，Y 和Z 是脯氨酸（Pro）和羥脯氨酸（Pro-OH）。由三條相同大小的多肽鏈組成的三螺旋結構是膠原的基本結構單元，其分子量約為285 kDa。使用質譜直接測定天然膠原蛋白的分子量仍然具有挑戰性，電噴霧電離質譜適合分析相對分子質量在20 萬以下的極性化合物，對于膠原蛋白來說，通常是在一定轉變溫度內，當三螺旋結構由三股膠原轉變為單鏈時測定。使用熱裂解氣質聯用儀（Py-GCMS）測試膠原蛋白可以通過裂解產物分析天然蛋白的分子結構，為分析蛋白質中的氨基酸組成提供了另一種思路。同時，新一代商用拉曼儀器促進了拉曼（Raman）光譜在生物科技和食品工業中的諸多應用，Raman 光譜已成為蛋白質科學的一種通用工具。圓二色（CD）光譜則可以分析膠原蛋白的三螺旋構象是否得以保留。目前，膠原蛋白海綿應用最廣泛的滅菌方法是

γ

-射線輻照。該方法被認為是最簡單和有效的滅菌方法，不會產生有毒物質，不會破壞化學鍵，不會降低拉伸強度和模量，從而不會從根本上影響到被輻照的材料。但是

γ

-射線輻照對于膠原蛋白三螺旋結構的影響尚不明確。本文使用Py-GCMS 對滅菌前后的膠原蛋白海綿的三螺旋結構進行測試，研究其輻照前后的結構變化，并使用Raman 光譜觀察輻照對膠原蛋白海綿三螺旋結構的影響，進一步通過對其CD 光譜數據進行計算來分析判斷輻照前后膠原蛋白海綿三螺旋結構的完整性是否發生改變。該工作可為膠原蛋白相關科研工作提供實驗參考，并可為膠原蛋白海綿的生產企業在研究輻照滅菌的劑量和時長方面的測試提供技術支撐。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 7890A/5975C 氣相色譜質譜聯用儀（美國Agilent 公司，配有美國CDS 公司 Pyroprobe 6150型熱裂解儀）；HR-800 型激光共焦Raman 光譜儀（Horiba Jobin Yvon 公司）；J-810 型圓二色光譜儀（日本Jasco 公司）。

所有試劑均為分析純；實驗用水為超純水（電阻率為18 MΩ·cm）。

1.2 樣品

未輻照膠原蛋白海綿：由武漢某生物材料有限公司提供，經由采用酸酶聯合法提取自牛跟腱的膠原蛋白原液（批號為YF19070001）冷凍干燥得到，使用前未做任何處理。輻照后膠原蛋白海綿：由同一生物材料有限公司提供，系同批號的未輻照膠原蛋白海綿經過

γ

-射線輻照后的樣品。

2 方法與結果

2.1 Py-GCMS

熱裂解參數：熱裂解溫度500℃；裂解時間6 s；閥溫325℃；傳輸線溫度350℃。色譜條件：色譜柱HP-5ms 彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent 公司）；載氣高純氦；柱流速1 mL·min；采用分流進樣，分流比20∶1；進樣口溫度280℃；柱溫40℃保持1 min，6℃·min升至300 ℃，保持10 min。

質譜條件：離子源EI；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；質量掃描范圍30 ～600

m/z

。準確稱取輻照前后的膠原蛋白海綿各1 mg，分別填入石英管，經熱裂解后進行GC-MS 全掃描分析，得到的總離子流圖見圖1。輻照前后的總離子流圖使用相同的積分參數進行處理，經NIST14 譜庫檢索得到譜峰對應的化合物，選取匹配度大于60%的產物列于表1，采用峰面積歸一化法計算面積百分比含量。表1 中產物主要分為乙腈類、吡咯環及衍生物類、酰胺類、芳烴和烷烴幾種，其中含吡咯環化合物占總裂解產物的比例分別為28%和23%，較好地說明了膠原蛋白海綿的結構組成。

表1 輻照前后膠原蛋白海綿裂解產物
Tab 1 Collagen sponge pyrolysis products before and after the irradiation

編號保留時間/min裂解產物結構式可能的來源峰面積百分比/%輻照前 輻照后11.763 乙腈脯氨酸1.381.21 22.539 乙酸images/BZ_74_1304_490_1412_512.pngimages/BZ_74_1304_531_1412_603.png提取使用的溶劑3.024.47 33.535 二甲基二硫images/BZ_74_1293_622_1423_662.png二硫鍵0.550.51 43.774 吡咯images/BZ_74_1318_681_1398_752.png脯氨酸3.113.52 53.910 甲苯images/BZ_74_1297_770_1419_838.png其他蛋白1.201.29 64.602 乙酰胺images/BZ_74_1307_856_1410_933.png脯氨酸和羥脯氨酸0.540.63 74.725 1-乙基-1H-吡咯images/BZ_74_1296_952_1421_1008.png脯氨酸和羥脯氨酸0.460.48 84.880 2-甲基吡啶images/BZ_74_1302_1027_1414_1099.png不明0.140.12 95.275 3-甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1292_1118_1425_1177.png脯氨酸和羥脯氨酸0.770.80 105.450 2-甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1304_1196_1412_1269.png脯氨酸和羥脯氨酸0.180.19 115.605 糠醇images/BZ_74_1293_1288_1424_1338.png不明0.070.09 125.696 間二甲苯images/BZ_74_1295_1357_1421_1426.png其他蛋白0.070.07 135.883 4-甲基吡啶images/BZ_74_1298_1445_1418_1512.png不明0.060.09 146.239 丙酰胺images/BZ_74_1293_1531_1423_1595.png脯氨酸和羥脯氨酸0.080.09 156.342 苯乙烯images/BZ_74_1301_1614_1415_1682.png其他蛋白0.120.13 167.209 3-乙基-1H-吡咯images/BZ_74_1280_1701_1436_1761.png脯氨酸和羥脯氨酸0.360.51 177.254 2，3-二甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1297_1780_1419_1872.png脯氨酸和羥脯氨酸0.14/187.474 2，5-二甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1304_1890_1413_1961.png脯氨酸和羥脯氨酸0.170.17 197.675 3-乙基-1H-吡咯images/BZ_74_1279_1980_1438_2037.png脯氨酸和羥脯氨酸0.140.15 207.798 2，3-二甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1300_2056_1416_2134.png脯氨酸和羥脯氨酸0.060.06 218.225 二甲基三硫images/BZ_74_1292_2153_1425_2200.png二硫鍵0.220.27 228.328 2-乙基-4-甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1278_2219_1439_2288.png脯氨酸和羥脯氨酸0.060.05 238.464 苯胺images/BZ_74_1289_2307_1428_2369.png不明0.05/248.949 3-乙酰基-1-甲基吡咯images/BZ_74_1284_2388_1432_2454.png脯氨酸和羥脯氨酸0.05/259.137 2-乙基-4-甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1269_2473_1447_2566.png脯氨酸和羥脯氨酸0.050.05 269.24 2-乙基-4-甲基-1H-吡咯279.305 乙酰胺images/BZ_74_1272_2585_1445_2657.pngimages/BZ_74_1235_2676_1482_2749.png脯氨酸和羥脯氨酸0.180.25不明0.05/289.363 2-氨基吡啶images/BZ_74_1275_2768_1441_2834.png不明0.490.68 299.590 2-乙基-4-甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1279_2853_1438_2923.png脯氨酸和羥脯氨酸0.180.18 309.700 2-乙基吡啶images/BZ_74_1290_2942_1426_3003.png不明0.170.17 31 10.165 4-乙基-3，5-二甲基-1H-吡咯images/BZ_74_1281_3022_1436_3129.png脯氨酸和羥脯氨酸0.040.07

續表1

編號保留時間/min裂解產物結構式可能的來源峰面積百分比/%輻照前 輻照后32 10.444 1-戊基-1H-吡咯33 10.663 2-乙酰基吡咯images/BZ_75_1269_454_1447_542.pngimages/BZ_75_1305_558_1404_636.png脯氨酸和羥脯氨酸0.070.11脯氨酸和羥脯氨酸0.070.17 34 10.78 1，3-辛二烯images/BZ_75_1202_662_1515_704.png脂肪0.130.17 35 11.013 對甲酚images/BZ_75_1281_723_1431_778.png其他蛋白0.170.40 36 11.052 間甲酚images/BZ_75_1291_798_1419_870.png其他蛋白0.20/37 11.543 3-乙基-2，5-二甲基-1H-吡咯38 11.601 2-氨基-3-甲基吡啶39 11.685 3-乙基-2，5-二甲基-1H-吡咯40 11.88 2，3-環戊烯并吡啶images/BZ_75_1276_893_1432_967.pngimages/BZ_75_1292_990_1421_1065.pngimages/BZ_75_1294_1086_1411_1194.pngimages/BZ_75_1299_1223_1411_1295.png脯氨酸和羥脯氨酸0.09/不明0.10/脯氨酸和羥脯氨酸0.130.11不明0.190.40 41 11.944 2，3，4，5-四氫吡啶images/BZ_75_1318_1318_1399_1385.png不明0.12/42 12.242 對氨基苯甲醚images/BZ_75_1270_1404_1446_1461.png其他蛋白0.09/43 12.332 吲哚images/BZ_75_1293_1480_1410_1550.png其他蛋白0.12/44 12.501 苯乙腈images/BZ_75_1285_1576_1421_1636.png其他蛋白0.650.78 45 13.057 3-氰基吡咯images/BZ_75_1270_1659_1446_1709.png脯氨酸和羥脯氨酸1.722.31 46 14.952 苯代丙腈images/BZ_75_1281_1728_1436_1820.png其他蛋白0.290.35 47 15.502 2-吡啶甲酰胺48 16.233 吲嗪49 16.576 2-哌啶基乙酸50 17.481 1H-吡咯-2-甲酰胺51 17.663 2-吡咯甲酸甲酯52 18.206 2-乙酰基-5-甲基咪唑53 24.552 2-isopropylidene-5，6，7，8-tetrahydro-2H-imidazo[1，2-a]pyridin-3-oneimages/BZ_75_1275_1839_1440_1912.pngimages/BZ_75_1290_1931_1427_2016.pngimages/BZ_75_1269_2035_1442_2108.pngimages/BZ_75_1285_2133_1432_2228.pngimages/BZ_75_1297_2247_1419_2330.pngimages/BZ_75_1284_2349_1432_2428.pngimages/BZ_75_1281_2447_1433_2534.png不明0.800.97脯氨酸和羥脯氨酸0.260.30不明0.32/脯氨酸和羥脯氨酸2.492.52脯氨酸和羥脯氨酸2.44/脯氨酸和羥脯氨酸0.240.33脯氨酸和羥脯氨酸0.760.77 54 24.739*O N N兩分子羥脯氨酸縮合脫去兩分子水和四個氫4.014.31 O 55 25.198 2H-naphtho[1，8-bc]thiophene，2-methyl-56 25.425 5-苯基-1，4-二甲基咪唑images/BZ_75_1298_2708_1412_2817.pngimages/BZ_75_1282_2838_1428_2927.png不明0.450.33不明1.111.78 57 25.651 cyclopropane，1-pentyl-2-propyl-images/BZ_75_1199_2952_1518_2997.png脂肪1.23/58 26.136 pyrrolo[1，2-a]pyrazine-1，4-dione，hexahydro-images/BZ_75_1284_3022_1432_3128.png脯氨酸和甘氨酸縮合脫去兩分子水4.834.15

續表1

注（Note）：結構式為推導得到（The structural formula was derived）。

編號保留時間/min裂解產物結構式可能的來源峰面積百分比/%輻照前 輻照后59 26.964 thiazolo[4，5-f]quinoline，7-methyl images/BZ_76_1254_444_1462_528.png不明0.170.30 60 27.126 exo-2-Methyl-endo-2-(acetylamino)norbornane images/BZ_76_1287_547_1429_613.png不明0.17/61 28.692*images/BZ_76_1291_631_1425_769.png兩分子脯氨酸縮合脫去兩分子水1.270.82images/BZ_76_1180_788_1536_849.png62 29.067 棕櫚酸脂肪3.562.04 63 29.468 2H-pyrrol-2-one，1，5-dihydro-4-(1-pyrrolidinyl)-images/BZ_76_1272_868_1444_952.png脯氨酸和羥脯氨酸0.37/64 30.47 1H-indolizino[8，7-b]indole-1-propanol，.beta.-ethyl-2，3，5，6，11，11b-h exahydro-images/BZ_76_1225_974_1492_1080.png脯氨酸和羥脯氨酸0.220.11 65 31.667 油酸images/BZ_76_1226_1099_1490_1220.png脂肪0.450.34 66 32.107 硬脂酸images/BZ_76_1198_1238_1518_1290.png脂肪3.92.01 67 32.767*images/BZ_76_1194_1309_1346_1438.pngimages/BZ_76_1383_1317_1522_1438.png羥脯氨酸和甘氨酸縮合脫去兩分子水；羥脯氨酸和脯氨酸縮合脫去兩分子水2.910.42 68 37.838 正二十六烷脂肪0.140.03 69 39.054 正二十七烷脂肪0.160.04 70 40.238 正二十八烷images/BZ_76_1180_1477_1536_1503.png脂肪0.220.05 71 40.626 角鯊烯images/BZ_76_1143_1594_1574_1617.pngimages/BZ_76_1170_1641_1546_1731.png脂肪0.16/72 41.377 正二十九烷脂肪0.250.06 73 43.912 膽固醇images/BZ_76_1121_1758_1596_1783.pngimages/BZ_76_1204_1807_1513_2002.png提取物0.210.27

圖1 γ-射線輻照前后膠原蛋白海綿的Py-GCMS 總離子流圖Fig 1 Total ion chromatogram of Py-GCMS collagen sponge before and after the gamma irradiation

膠原蛋白三螺旋是由三條相同或不同的膠原蛋白肽相互纏繞得到特征的右手三螺旋，其中每一條多肽鏈各自采取左手螺旋的聚脯氨酸Ⅱ型（polyproline type Ⅱ，PPⅡ）螺旋結構，見圖2，通過熱裂解質譜可以觀察到膠原蛋白組成中的三種氨基酸兩兩通過肽鍵縮合形成的哌嗪二酮（diketopiperazine，DKP）特征結構，在裂解產物列表中可見5 個DKP 結構，對應峰編號為54、58、61、67（含兩個峰），其質譜圖分別見圖3，對應的產物分析見圖4。從圖4 中可以看出，兩分子氨基酸之間的縮合以羧酸和氨基反應脫去兩分子水為主，而當羥脯氨酸自身縮合時，由于結構中還存在羥基，脫去了四分子水和四分子氫。這些DKP產物印證了膠原蛋白海綿的分子結構。在總離子流圖中，輻照后的樣品第67 號峰高出現明顯下降，說明輻照對于膠原蛋白海綿的結構產生了一定影響，證實輻照導致了膠原蛋白三螺旋結構中局部羥脯氨酸與甘氨酸和脯氨酸的連接丟失，自身的共價交聯度變低。值得注意的是，當裂解溫度不變而裂解時長加長至1 min 時或樣品風干后，結果類似，即第67 號峰出現明顯下降或消失，這說明輻照、溫度、失水等因素對羥脯氨酸與甘氨酸和脯氨酸的影響一致，而且羥脯氨酸與甘氨酸和脯氨酸的連接相較其他連接而言對這些因素更為敏感。

圖2 膠原蛋白三螺旋結構片段的平面圖（a）和球-棒圖（b）Fig 2 Plane graph （a） and ball-and-stick graph（b） of segments of triple-helix collagen

圖3 Hyp-Hyp（a），Pro-Gly（b），Pro-Pro（c），Gly-Hyp（d），Pro-Hyp（e）的DKP 質譜圖Fig 3 DKP mass spectra of Hyp-Hyp（a），Pro-Gly（b），Pro-Pro（c），Gly-Hyp（d），and Pro-Hyp（e）

圖4 裂解產物中DKP 的分析Fig 4 DKP in pyrolysis products

2.2 Raman

將輻照前后的膠原蛋白海綿放在樣品臺上進行常溫Raman 光譜測試。激發源為Nd-YAG：532 nm，采用600 gr/mm 光柵，×50LWD 物鏡，200 μm 針孔，60 s 曝光時間，為避免激光高溫灼傷樣品，在樣品表面覆蓋一片薄的石英片。測試前，使用單晶硅對峰位進行校準。測試得到Raman 光譜圖，見圖5。

圖5 γ-射線輻照前后膠原蛋白海綿的拉曼光譜圖Fig 5 Raman spectra of collagen sponge before and after the gamma irradiation

對Raman 光譜圖進行基線校正和歸一化處理，基線校正采用Labspec5 軟件（Labspec；Horiba Jobin Yvon，Japan）。在光譜分析中沒有使用去噪或平滑處理。脯氨酸和羥脯氨酸吡咯烷環上亞甲基的反對稱和對稱伸縮振動峰，以及酰胺A 帶、Ⅰ帶和Ⅲ帶是Raman 光譜的主要組成部分。酰胺Ⅱ帶在紅外光譜中很強，但在Raman 光譜中很弱。主要譜峰的歸屬見表2。獲得的Raman光譜數據在

γ

-射線輻照前后幾乎相同，但當用最高峰歸一化時，我們發現輻照后的譜峰強度普遍得到了增強，說明輻照對膠原的交聯結構產生了一定影響。根據Born-vonkamann 周期性條件，Raman 頻率滿足

λ

＝

π/

N，式中，

π

為常數，N 是碳原子數目，由于膠原蛋白中N 值超過10 000，所以少量碳原子數目變化不會影響Raman 位移。因此，在本實驗中，輻照前后樣品的Raman 頻移變化不大。但強度有變化，是由于Raman 光譜對氫鍵網絡結構和酰胺附近的條件很敏感，共價交聯鏈局部斷裂后氫鍵作用力減弱，使得分子鍵的振動加劇，從而強度得以增強。

表2 膠原蛋白海綿拉曼光譜數據解析
Tab 2 Raman spectra data of collagen sponge

輻照前輻照后波數/cm－1 強度/%波數 /cm－1 強度 /%歸屬3321 233313 25 ν 對稱（N-H），酰胺A 帶29411002941100 ν 反對稱（CH2）2883 452883 48 ν 對稱（CH2）1664 231664 32 ν 反對稱（C ＝O），酰胺Ⅰ帶1448 281449 36 δ（CH2），亞甲基的剪式振動1265 251265 32 ν（C-N），δ（N-H），酰胺Ⅲ帶1243 281243 35 ν（C-N），δ（N-H），酰胺Ⅲ帶936 28 936 33 ν（C-C），脯氨酸和羥脯氨酸中與羰基相連的碳碳鍵伸縮振動854 25 854 30 ν（C-C），脯氨酸和羥脯氨酸中的吡咯烷環骨架振動

2.3 CD 光譜

準確稱取輻照前后的膠原蛋白海綿，使用0.01 mol·L乙酸水溶液溶解稀釋為0.1 mg·mL的溶液，于4 ℃冰箱放置過夜，測試前于室溫下放置1 h，注入1 mm 光程的圓形比色皿中（型號：31/B/Q/1，Starna Scientific Ltd.Hainault，Essex IG6 3UT，United Kingdom）。設置帶寬為1 nm，響應時間0.5 s，標準靈敏度，掃描范圍為190 ～260 nm。為了防止CD 光譜變形，掃描速度（nm·s）和響應時間（s）的乘積應小于半高寬的10%（蛋白質光譜的半高寬通常約為15 nm）。本實驗設置響應時間為0.5 s，掃描速度為100 nm·min，再通過數據平滑處理降低噪聲，得到高質量的CD 光譜圖，見圖6。

圖6 室溫下γ-射線輻照前（a）和輻照后（b）膠原蛋白海綿溶液的CD 光譜圖Fig 6 CD spectra of collagen solution before（a）and after（b）the gamma irradiation at room temperature

對于天然膠原蛋白，理想的CD 光譜是出現221 nm 處的明顯正峰和198 nm 處的負峰。在本研究中，醫用膠原海綿樣品的三螺旋構象由圖6 中的CD 光譜證實。CD 光譜圖中顯示負峰和正峰，這表明膠原海綿在

γ

-射線輻照前后呈正常的三螺旋結構。此外，可以使用兩個峰（221 nm 處的正峰，198 nm 附近的負峰）的強度比值計算的正負峰強度比（ratio of positive to negative peak intensity，Rpn）用于估計溶液中的三螺旋構象。在本實驗中，兩個膠原海綿樣品顯示出良好的Rpn，輻照前Rpn 為0.15，輻照后Rpn 為0.11，表明輻照滅菌后保留了三螺旋結構。

3 結論

對于膠原蛋白產品來說，完整的三螺旋結構是保持其穩定性、機械性能和生物活性的重要保證，對膠原蛋白三螺旋結構的理解也將有利于指導用于生物醫學和納米技術的人工膠原材料的進一步開發，因此有必要對其三螺旋結構進行分析。本文聯合Py-GCMS 質譜法和兩種光譜方法（Raman 及CD）對輻照前后膠原蛋白海綿的結構進行了討論，詳細分析了熱裂解產物，并對組成膠原蛋白的3 種氨基酸兩兩通過肽鍵縮合形成的DKP 結構進行了推導，證實了膠原蛋白的三螺旋結構在輻照后發生了肽鏈的變化。Raman 光譜數據進一步佐證了這一變化，局部肽鏈斷裂導致交聯度降低。通過對CD 光譜的計算和分析，結果表明，輻照前后醫用膠原蛋白海綿的三螺旋結構得以保持。聯合質譜法和光譜法對膠原蛋白進行分析，有助于更好地理解其三螺旋結構，為膠原蛋白相關科研和膠原蛋白海綿生產企業提供參考依據。