香煙煙霧顆粒通過MAPK和NF-κB信號通路上調內皮素受體誘導大鼠腸系膜動脈平滑肌收縮

張盼，王鈺瑩，王婷，史永恒，2，劉繼平，2，徐倉寶，胡銳，2*，王川，2*（.陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 72046；2.陜西省中醫藥管理局中藥藥效機制與物質基礎重點研究室，陜西 咸陽 72046；.西安醫學院基礎與轉化醫學研究所/陜西省缺血性心血管疾病重點實驗室，西安 7002）

吸煙是危害人類健康的主要因素之一。吸煙不僅對人類呼吸系統產生嚴重的損害，導致哮喘、慢性阻塞性肺病、肺癌等多種肺部疾病，而且也是冠心病、高血壓、中風等多種疾病的危險因子。煙草煙霧中有4000 多種化學物質，其中尼古丁、一氧化碳、多環芳香烴和氧自由基等與心血管的損害直接相關。大量的臨床研究和動物實驗均證實，吸煙可以顯著增加心血管系統疾病的患病風險。據《中國心血管健康與疾病報告》報道，全球每年約190 萬人因煙草使用或二手煙暴露引發的冠心病而失去生命，約占全球因冠心病死亡的20%。內皮素（endothelin，ET）是一種強烈且持久收縮血管的多肽，主要由血管中的內皮細胞合成及分泌。內皮素受體（endothelin receptor）有兩種亞型，分別為A 亞型（ETA）和B 亞型（ETB），在生理條件下，ETA 受體主要存在于血管平滑肌細胞中，介導血管收縮，而ETB 受體主要在血管內皮細胞上表達，促進一氧化氮和前列環素的產生，誘導血管舒張；然而，在病理條件下，ETB 受體在平滑肌細胞中大量表達，并且介導血管收縮。內皮素及其受體與多種心血管疾病的發病相關，在高血壓和冠心病患者中，血管平滑肌上ETA 和ETB 受體上調。越來越多的證據表明，吸煙和血管痙攣可能與血管平滑肌細胞中內皮素受體的上調有關。絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK） 信號通路主要包括胞外信號調節激酶1 和2（extracellular signal-regulated protein kinase 1 and 2，ERK1/2）、c-Jun N 端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和P38 蛋白激酶通路，調控細胞內的信號轉導，在心血管疾病中具有重要的作用。核因子

κ

B（nuclear factor-kappa B，NF-

κ

B） 是MAPK 下游的重要轉錄因子之一，調控基因的表達。MAPK/NF-

κ

B 信號通路的激活與動脈血管收縮密切相關，大量的研究表明，低密度脂蛋白、細顆粒物PM和香煙煙霧顆粒（DSP）等均可以損傷動脈血管，激活MAPK/NF-

κ

B 信號轉導通路介導的轉錄和翻譯，合成新的收縮性受體（如血栓素受體、腎上腺素受體和內皮素受體等），導致血管平滑肌收縮，甚至引起血管痙攣。本課題組前期的研究也表明，DSP 通過ERK1/2 信號通路上調腎上腺素

α

受體誘導血管平滑肌收縮。內皮素受體在血管收縮中起重要作用，但DSP 對ETA 和ETB 受體的作用機制還不十分清楚。為了進一步研究其作用機制，本實驗采用SD 大鼠離體腸系膜動脈培養模型，將分離的大鼠腸系膜動脈，制成血管環進行器官培養，將特異性的細胞內信號通路抑制劑加到培養基中，以檢驗不同信號通路的參與情況；并通過肌張力描記技術記錄血管環的張力變化，依次在血管環浴槽中加入選擇性受體激動劑，觀察內皮素受體介導的血管收縮；Western blot 法檢測相關蛋白的表達，通過研究DSP 調節ETA 和ETB 受體的作用及機制，為預防和治療與吸煙有關的心血管疾病提供新的思路。

1 材料

1.1 動物

雄性SD 大鼠，SPF 級，6 ～8 周齡，體質量200 ～250 g [成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（川）2020-030]，動物飼養于陜西中醫藥大學中藥藥理實驗室，飼養期間動物自由飲水進食。動物實驗經陜西中醫藥大學倫理委員會批準。

1.2 試藥

角蝰毒素6C（S6C，ETB 受體激動劑，Sigma-Aldrich，批號：097M4843V）、ET-1（Sigma-Aldrich，批號：088M4849V）、U0126（ERK1/2 通路抑制劑，批號：19826）、SP600125（JNK 通路抑制劑，批號：13775）、SB203580（P38 通路抑制劑，批號：10206）和Bay-117082（NF-

κ

B 通路抑制劑，批號：17893）（MedChemExpress 公司）；ETA 受體抗體（Abcam，批號：ab117521），ETB 受體抗體（GeneTex，批號：39603），p-ERK1/2（批號：4370S）、ERK1/2（批號：4695S）、p-P38（批號：4511S）、P38（批號：8690S）、p-NF-

κ

B P65（批號：3039S）和NF-

κ

B P65（批號：8242S）抗體（CST 公司）；

β

-actin 抗體（武漢博士德，批號：17353873）；青霉素/鏈霉素溶液-雙抗（HyClone 公司，批號：J190033）。

1.3 儀器

DMT 630M 離體微血管張力測定系統（丹麥DMT 公司）；CO培養箱（美國Thermo Scientific公司）；Powerlab 生物信號采集處理系統（澳大利亞ADI 公司）；電泳儀、轉膜儀及化學發光系統（美國Bio-rad 公司）。

2 方法

2.1 DSP 的制備

將點燃的3 支萬寶路香煙通過負壓經過脫脂棉球，將脫脂棉球浸入1 mL DMSO 中使其附著物充分溶解，過濾除菌即得DSP。

2.2 腸系膜動脈環培養及分組、給藥

SD 大鼠斷頸處死，體視顯微鏡下分離出腸系膜動脈，使用Triton X-100 去除內皮，腸系膜動脈剪成約2 mm 的血管環，每段血管環加入DMEM 高糖培養基1 mL，按不同實驗設計進行分組與給藥：在培養基中加入DSP 或溶劑對照（DMSO）或MAPK 信號通路抑制劑（U0126、SP600125、SB203580） 或NF-

κ

B 通路抑制劑（Bay-117082），培養板置于CO培養箱中培養24 h。

2.3 離體肌張力描記

將培養的動脈環穿入兩根直徑為40 μm 的金屬絲，一根金屬絲與可調節預張力的張力微調裝置相連，另一根連接張力換能器。恒溫離體浴槽內加入5 mL Na-PSS 溶液（Na-PSS 液組成為NaCl 119 mmol·L，NaHCO15 mmol·L，KCl 4.6 mmol·L，MgCl1.2 mmol·L，NaHPO1.2 mmol·L，CaCl1.5 mmol·L和葡萄糖 5.5 mmol·L）。固定好的動脈環平衡40 min 后，施加2 mN 的預張力，加入5 mL 60 mmol·LK-PSS 液（K-PSS 液組成為NaCl 63.6 mmol·L，NaHCO15 mmol·L，KCl 60 mmol·L，MgCl1.2 mmol·L，NaHPO1.2 mmol·L，CaCl1.5 mmol·L和 葡 萄糖 5.5 mmol·L）檢驗動脈環收縮活性，使用乙酰膽堿檢測內皮功能，若乙酰膽堿引起的舒張率＜10%，認為內皮已被去除。采用梯度累加法加入特異性ETB 受體激動劑S6C 和ETA 受體激動劑ET-1，觀察濃度-收縮曲線。

2.4 Western blot 檢測相關蛋白的表達

培養的大鼠腸系膜動脈使用RIPA 裂解液提取總蛋白，采用BCA 法檢測蛋白含量，蛋白樣品經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉印至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL 發光試劑顯影，使用化學發光成像系統進行拍照，檢測目標條帶的光密度值，分析相關蛋白表達。

2.5 統計學分析

所有數據用均數±標準差表示。激動劑在血管環上引起的收縮用K-PSS 溶液引起的收縮的百分數表示，

E

是激動劑產生的最大收縮。使用SPSS 25.0 軟件采用單因素方差分析（ANOVA）進行多組數據間的比較，

P

＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 DSP 對ETA 和ETB 受體介導的收縮反應的影響

離體動脈血管在含DSP（0.1、0.2 和0.4 μL·mL）的培養液中培養24 h，梯度累加法加入S6C（1×10～1×10mol·L）， 圖1B 結果顯示，與DMSO 對照組相比，DSP 0.2 μL·mL對S6C 引起的收縮增強，量效曲線顯著左移（

P

＜0.01）。ETB 受體激動劑S6C 加入浴槽60 min 后，收縮曲線回到基線，使ETB 受體脫敏，再按梯度累加法加入ET-1（1×10～1×10mol·L），激動ETA 受體，結果表明，DSP 0.2 μL·mL和DSP 0.4 μL·mL可以明顯地增強ET-1 的收縮作用，濃度-收縮曲線明顯左移（

P

＜0.05 或

P

＜0.01），因此DSP 的使用濃度選擇為DSP 0.2 μL·mL。

圖1 DSP 對S6C 和ET-1 誘導的濃度-收縮曲線的影響Fig 1 Effect of DSP on concentration-contractile curves induced by S6C and ET-1 in a concentration-dependent manner

3.2 MAPK 通路抑制劑對DSP 誘導ETA 和ETB受體介導的收縮反應的影響

為了考察MAPK 通路是否參與了內皮素受體介導的動脈收縮，采用0.2 μL·mL的DSP與U0126、SP600125 或SB203580（濃度均為10 μmol·L）共同培養24 h。結果如圖2 所示，與DSP 組相比，U0126 可以抑制ETB 受體激動劑S6C 和ETA 受體激動劑ET-1 誘導的收縮反應，S6C 誘導收縮的

E

從（204.3±29.5）%降低為（2.56±1.17）%（

P

＜0.01），ET-1 誘導收縮的

E

從（372.5±60.3）%降低為（123.1±26.7）%（

P

＜0.01）；SP600125 對S6C 和ET-1 誘導的收縮反應沒有顯著影響；SB203580 可以顯著抑制ETB受體激動劑S6C 和ETA 受體激動劑ET-1 誘導的收縮反應，S6C 誘導收縮的

E

從（200.6±26.9）%降低為（38.9±9.8）%（

P

＜0.01），ET-1 誘導收縮的

E

從（343.8±33.2）%降低為（239.3±42.4）%（

P

＜0.05）。

圖2 MAPK 抑制劑對S6C 和ET-1 介導收縮的影響Fig 2 Effect of MAPK inhibitors on S6C and ET-1 induced contraction

Western blot 檢測結果表明，DSP 組ETB 和ETA 受體蛋白表達升高，DSP ＋U0126 組ETB 和ETA 受體蛋白表達降低，DSP 組p-ERK1/2 蛋白的表達升高，DSP ＋U0126 組p-ERK1/2 蛋白的表達降低；DSP ＋SB203580 組ETB、ETA 受體蛋白和p-P38 蛋白的表達均降低（

P

＜0.05 或

P

＜0.01）。以上結果表明ERK1/2 和P38 可能參與了DSP 上調ETA 和ETB 受體引起的血管收縮（見圖3）。

圖3 腸系膜動脈ETA、ETB 受體和MAPK 通路蛋白的表達Fig 3 Protein expression of ETA，ETB receptor and MAPK pathways in mesenteric arteries

3.3 NF-κB 通路抑制劑對DSP 誘導ETA 和ETB受體介導的收縮反應的影響

為了研究NF-

κ

B 信號通路是否參與了DSP誘導的收縮，采用NF-

κ

B 通路抑制劑Bay-117082（10 μmol·L）與0.2 μL·mLDSP 共培養24 h。圖4A 結果顯示，與DSP 組相比，Bay-117082 可以顯著抑制S6C 誘導的收縮反應，DSP 組的

E

為（214.6±56.2）%，DSP ＋Bay-117082 組 的

E

為（165.9±30.2）%（

P

＜0.05）；與DSP 組相比，Bay-117082 對ET-1 誘導的收縮反應沒有明顯影響。Western blot 結果表明，Bay-117082 可以顯著抑制ETB 受體的表達，而對ETA 受體的表達沒有明顯影響。與DMSO 組相比，DSP 顯著增加了p-P65 蛋白表達；與DSP 組相比，DSP ＋Bay-117082 組p-P65 蛋白表達降低。以上結果表明NF-

κ

B 信號通路可能參與了DSP 上調ETB 受體介導的血管收縮（見圖5）。

圖4 NF-кB 抑制劑Bay-117082 對S6C（A）和ET-1（B）介導收縮的影響Fig 4 Effect of NF-кB pathway inhibitor Bay-117082 on S6C（A）and ET-1（B）induced contraction

圖5 腸系膜動脈ETA、ETB 受體和p-P65 蛋白的表達Fig 5 Protein expression of ETA，ETB receptor and p-P65 in mesenteric arteries

4 討論

吸煙與心血管疾病的發病密切相關，然而，吸煙導致血管痙攣的分子機制尚不清楚。內皮素與多種心血管疾病的發病機制有關，ET-1 是目前作用最強的內源性血管收縮劑，引起血管強烈且持久的收縮，ET-1 通過與血管平滑肌表面特異性內皮素受體（ETA 和ETB）結合，產生收縮血管的作用，刺激血管平滑肌細胞增殖、遷移，引起動脈血管重塑以及細胞外基質合成等多種生物學效應，使動脈血管的血管壁增厚和順應性降低，導致血管阻力增加。內皮素還參與了原發性高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病、充血性心力衰竭、肺動脈高壓、腦血管疾病急性腎衰竭、多囊腎病和慢性腎臟疾病。大量的實驗證明，在高血壓患者的動脈、心肌梗死患者缺血區的動脈和自發性高血壓大鼠動脈等中內皮素受體的表達上調，內皮素受體介導的動脈收縮參與了心血管疾病的發生與發展。

本研究通過離體血管培養技術，從大鼠腸系膜動脈平滑肌收縮功能和相關蛋白表達方面研究了DSP 對內皮素受體作用及其相關信號通路。研究結果表明，DSP 可以使腸系膜動脈環對S6C（ETB 受體激動劑）的收縮作用呈濃度依賴性，收縮量效曲線左移，與DMSO 相比，0.2 μL·mLDSP 使血管的收縮反應明顯增強。在ETB 受體脫敏后按累加濃度法加入ET-1，激動ETA 受體，DSP 對ETA 受體介導的收縮反應也明顯增強。MAPK 信號通路在血管痙攣和動脈高反應性中發揮著重要的作用，部分心血管危險因子刺激動脈平滑肌細胞上的G 蛋白偶聯受體而激活MAPK 信號轉導通路參與平滑肌收縮反應，如5-羥色胺、血管緊張素Ⅱ、血栓素、腎上腺素

α

1 和內皮素等G 蛋白偶聯受體引發的收縮機制中均有MAPK 通路參與。本課題組前期的研究也表明，DSP 激活ERK1/2-MAPK 信號通路，上調腎上腺素

α

受體的表達，使血管收縮作用增強。本研究使用MAPK 信號通路抑制劑與DSP 共培養研究MAPK 通路對DSP 刺激引起的ETA 和ETB 受體上調的影響，發現U0126（ERK1/2 通路抑制劑）和SB203580（P38 通路抑制劑）可以顯著抑制S6C 和ET-1 誘導的收縮反應；DSP 上調ETA 和ETB 受體的表達，活化ERK1/2 和P38 通路， 而U0126 和SB203580 抑制了ETA 和ETB 受體的表達，降低了p-EKR1/2或p-P38 的蛋白表達，表明ERK1/2 和P38 通路可能參與了DSP 上調ETA 和ETB 受體介導的血管收縮，而JNK 抑制劑SP600125 對S6C 和ET-1誘導的收縮反應沒有顯著影響，提示DSP 誘導內皮素受體的上調可能與JNK 信號通路無關。DSP激活MAPK 信號通路中的ERK1/2 和P38 通路，而不激活JNK 通路，介導動脈平滑肌ETA 和ETB 受體上調，導致血管平滑肌呈高反應性，增強血管收縮，甚至引起血管痙攣。NF-

κ

B 是MAPK 下游的重要轉錄因子之一，Bay-117082（NF-

κ

B 抑制劑）可以顯著的抑制S6C 誘導的收縮反應，而對ET-1 誘導的收縮反應沒有明顯的影響。Western blot 結果也表明，Bay-117082 可以抑制ETB 受體的表達，而對ETA 受體沒有明顯的影響。P-65 蛋白是NF-

κ

B家族中的代表蛋白，DSP 激活使p-P65 蛋白的表達增加，而Bay-117082 可以降低p-P65 蛋白的表達，表明NF-

κ

B 可能參與了DSP 上調ETB 受體介導的血管收縮，而ETA 受體上調可能與NF-

κ

B信號通路無關，提示ETA 受體的上調可能與轉錄后機制有關，后續將進一步深入研究。

本研究也存在一定局限性，香煙煙霧中有4000 多種成分，我們無法得知香煙中的哪些成分刺激血管平滑肌導致內皮素受體上調；其次，血管內皮被去除，主要目的在于排除內皮功能的影響，針對性地研究DSP 引起平滑肌內皮素受體介導的收縮反應，但內皮細胞與平滑肌細胞的相互作用無法體現。

綜上所述，DSP 通過激活MAPK/NF-

κ

B 通路，激活轉錄及翻譯，合成新的內皮素受體，使血管平滑肌內皮素受體表達上調，從而增強血管收縮。因此，阻斷MAPK 和NF-

κ

B 信號轉導通路，抑制內皮素受體上調，改善血管平滑肌高反應性，有望成為治療血管痙攣等心血管疾病的新思路和藥物開發的新靶點。