甘草次酸減輕放射性皮膚纖維化的作用機制

蘇麗，潘曉嫻，王彩虹，洪金省，王锃

放射治療是抗腫瘤治療的主要手段之一。皮膚是放療外照射的必經途徑，因此放射性皮膚損傷不可避免。損傷的早期輕者表現為脫毛、可逆的急性皮炎，重者可出現軟組織潰瘍或壞死，后期可進一步發展為放射性纖維化。輻射引起的皮膚纖維化是永久性的、進行性的、不可逆的，對放療的實施、器官功能和患者的生活質量均有嚴重影響[1-2]。目前尚無治療放射性皮膚纖維化的特效藥物[3]。

放射性纖維化的形成與發展是一個復雜的動態變化的過程，電離輻射誘導皮膚組織損傷后，啟動了相關的免疫損傷修復。成纖維細胞(fibroblast,FB)激活并轉化為肌纖維母細胞(myofibroblast,MFB)，過多的 MFBs 分泌大量Ⅰ型膠原(type Ⅰ collagen,ColⅠ)[4]，導致細胞外基質(extracellular matrix,ECM)過度沉積、基質硬化，表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)等導致組織過度收縮、順應性下降，最終導致纖維化。FB的活化在纖維化發展過程中發揮了關鍵性作用[5]，抑制FB的活化是治療放射性皮膚纖維化的重點。

18β-甘草次酸(18β-glycyrrhetinic acid,18β-GA)是甘草酸的生物活性代謝物，是由甘草酸水解脫去糖酸鏈而形成的功能性產物，具有抗炎、抗氧化、免疫調節和抗纖維化等多種藥理作用[6]。課題組前期研究[7]發現，18β-GA可以抑制輻射誘導的細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)升高，抑制皮膚急性損傷期許多致炎細胞因子和趨化因子升高，顯示出抗炎和抗氧化能力，具有減輕急性放射性皮炎的作用。然而，18β-GA對放射性皮膚纖維化的作用仍有待進一步研究。因此，本研究通過構建放射性皮膚纖維化的細胞和動物模型，探討18β-GA減輕放射性皮膚纖維化的作用及其機制，為臨床上放射性皮膚損傷的防治提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料 直線加速器(Clinac 600C/D，美國Varian醫療系統公司)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(P0012，中國碧云天生物技術有限公司)，ColⅠ(C3867，美國Sigma-Aldrich公司)，抗纖維連接蛋白(fibronectin，FN)抗體(A12932，武漢愛博泰克生物科技有限公司)、抗ColⅠ抗體(A1352，武漢愛博泰克生物科技有限公司)、抗-α-SMA抗體(A7248，武漢愛博泰克生物科技有限公司)、抗-β-actin抗體(AC026，武漢愛博泰克生物科技有限公司)、10% 新生牛血清(SH30413，美國HyClone公司)、RIPA裂解緩沖液(P0013C，中國碧云天生物技術有限公司)、TRITC標記山羊抗兔IgG(H&L)二抗(ab6792，英國Abcam公司)。小鼠胚胎成纖維細胞(NIH 3T3)[中國科學院細胞庫(上海)]。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及照射 8周齡SPF級雌性ICR小鼠，體質量25～30 g [上海斯萊克動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2007-0005]。將小鼠隨機分為4組：正常對照組(Control)，照射組(IR)，IR+GA組，IR+生理鹽水(NS)組。每組10只，每籠5只。其中，IR組、IR+GA組和IR+NS組小鼠背部皮膚接受6 MV X射線單次35 Gy照射，源皮距為 100 cm，劑量率為5 Gy/min，照射的區域和具體的方法參考文獻[8]。IR+GA組小鼠在照射前接受18β-GA單次灌胃(25 mg/kg)，照射后繼續灌胃(25 mg/kg)處理，每周3次。IR+NS組小鼠照射后給予IR+GA組小鼠相同體積的生理鹽水。假照射小鼠被放置在相同的房間同等時間，作為正常對照組。照射后第10周處死小鼠，取皮膚組織進行進一步分析。

1.2.2 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,H-E)染色及免疫組織化學染色 4%多聚甲醛溶液固定小鼠皮膚組織，石蠟包埋，連續0.4 μm切片，采用H-E染色和Masson三色染色法進行染色。免疫組織化學染色時，皮膚組織用抗α-SMA(1∶1 000)一抗室溫孵育2 h，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌后，切片與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗在室溫下孵育 30 min。用PBS洗滌 3 次后，滴加鏈霉親和素-生物素復合物(strept avidin-biotin complex,SABC)室溫孵育 30 min，PBS洗滌 3 次。將載玻片與二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)反應 3 min，蘇木精復染 2 min后脫水、封片。

1.2.3 細胞培養、照射及分組 使用含10%新生牛血清的高糖DMEM培養基培養小鼠胚胎NIH 3T3細胞。根據不同處理將細胞分為4組：Control組，IR組，IR+GA組，IR+二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)組。IR組、IR+GA組和IR+DMSO組均給予單次6 Gy的照射(6 MV X射線，射野角度180°，單野照射；劑量率，2 Gy/min；源皮距，100 cm)，培養皿下方墊1 cm的組織補償物。IR+GA組在照射前使用18β-GA(20 μmol/L)預處理24 h。IR+DMSO組作為溶劑對照組，在照射前使用與IR+GA組相同體積的DMSO預處理同等時間。

1.2.4 細胞免疫熒光染色 無菌條件下在12孔板內放置圓形直徑20 mm的細胞爬片。細胞照射后繼續培養72 h，用PBS短暫沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，正常山羊血清37 ℃下封閉1 h，加入抗α-SMA抗體，4 ℃孵育過夜，采用TRITC標記的山羊抗兔IgG二抗孵育1.5 h，再使用PBS洗滌細胞，室溫下4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-Diamidino-2’-phenylindole，DAPI)染色5 min。共聚焦熒光顯微鏡下觀察免疫熒光結果。

1.2.5 Western-blot檢測蛋白表達 用RIPA裂解緩沖液制備小鼠皮膚組織和細胞的蛋白質樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。嚴格按照Western-blot標準檢測FN、ColⅠ、α-SMA蛋白表達。

1.2.6 膠原凝膠收縮活動 NIH 3T3細胞照射前使用18β-GA預處理24 h后，給予單次6 Gy X射線照射，將1×105mL-1細胞與ColⅠ混合,使ColⅠ 的終濃度為1 mg/mL，培養72 h后，采用ImmunoSpot 系統拍攝凝膠收縮圖像，通過Image J軟件進行凝膠收縮程度的定量分析。

2 結 果

2.1 18β-GA對小鼠放射性皮膚纖維化的作用

2.1.1 小鼠背部皮膚組織的病理變化及 α-SMA 的表達 照射后第10周，小鼠背部皮膚出現明顯的纖維化特征，皮膚組織結構紊亂，表皮增厚，真皮層厚度顯著增加，膠原纖維增厚增多，纖維排列緊密，間隙縮小。真皮的毛囊結構明顯被破壞或消失。皮脂腺、汗腺明顯減少甚至消失，脂肪層變薄或消失。與IR組比較，IR+GA組小鼠病理改變明顯改善，皮膚真皮層變薄，膠原纖維數量明顯減少，炎癥細胞浸潤減少，毛囊、皮脂腺、汗腺受損情況減輕。Masson 染色顯示，與正常組織比較，照射后小鼠皮膚膠原沉積顯著，18β-GA可以減少真皮膠原沉積。免疫組織化學顯示，照射后小鼠皮膚組織內α-SMA的表達增加，給予GA處理后輻射誘導的α-SMA的表達增加被抑制(圖1)。

Control：正常對照；IR：照射；GA：18β-甘草次酸；NS：生理鹽水；H-E染色：蘇木精-伊紅染色；Masson：馬松染色；α-SMA：α-平滑肌肌動蛋白。圖1 小鼠背部皮膚組織照射后第10周的病理變化( ×200)Fig.1 Pathological changes of dorsal skin tissue of mice at 10 weeks after irradiation ( ×200)

2.1.2 18β-GA對照射后小鼠皮膚組織中FN、ColⅠ和α-SMA蛋白表達的影響 X射線照射后，小鼠皮膚組織中FN、ColⅠ和α-SMA表達水平升高；18β-GA 處理后，X射線誘導的α-SMA、ColⅠ和FN的表達水平下降(圖2)。

Control：正常對照；IR：照射；GA：18β-甘草次酸；NS：生理鹽水；α-SMA：α-平滑肌肌動蛋白；Collagen Ⅰ：Ⅰ型膠原；Fibronectin：纖維連接蛋白。A：Western-blot檢測各組小鼠皮膚組織中Fibronectin、Collagen Ⅰ和α-SMA的表達；B：Fibronectin蛋白相對表達量；C：Collagen Ⅰ蛋白相對表達量；D：α-SMA蛋白相對表達量。與Control組比較，#：P<0.05；與IR組比較，△：P<0.05。圖2 各組小鼠皮膚組織中Fibronectin、Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白的表達Fig.2 Fibronectin,Collagen Ⅰ and α-SMA protein expression in skin tissues of each groups of mice

2.2 IR誘導NIH 3T3活化 與未照射細胞(0 Gy)比較，4、6、8 Gy照射后，細胞內FN、ColⅠ和α-SMA 的表達均增加，差別有統計學意義(P<0.05，圖3)。NIH 3T3細胞接受6 Gy X射線照射，分別于照射后24、36、48和72 h檢測細胞內FN、ColⅠ和α-SMA 表達，結果顯示：照射后72 h細胞內FN、ColⅠ和α-SMA的表達水平較未照射時明顯升高，差別有統計學意義(P<0.05，圖3)。

NIH 3T3：小鼠胚胎成纖維細胞；α-SMA：α-平滑肌肌動蛋白。A：Western-blot檢測接受不同劑量 X 射線照射后的NIH 3T3細胞內Fibronectin、Collagen Ⅰ和α-SMA的表達；B：不同劑量 X 射線照射后的NIH 3T3細胞內Fibronectin蛋白相對表達量；C：不同劑量 X 射線照射后的NIH 3T3細胞內Collagen Ⅰ蛋白相對表達量；D：不同劑量X射線照射后的NIH 3T3細胞內α-SMA蛋白相對表達量；E：Western-blot檢測6 Gy X射線照射后不同時間的NIH 3T3 細胞內Fibronectin、Collagen Ⅰ和α-SMA的表達；F：NIH 3T3細胞照射后不同時間Fibronectin蛋白相對表達量；G：NIH 3T3細胞照射后不同時間Collagen Ⅰ蛋白相對表達量；H：NIH 3T3 細胞照射后不同時間α-SMA 蛋白相對表達量。與對照組比較，#：P<0.05。圖3 NIH 3T3細胞接受不同照射劑量和照射后不同時間Fibronectin、Collagen Ⅰ和α-SMA的表達Fig.3 Expression of Fibronectin,Collagen Ⅰ and α-SMA in NIH 3T3 cells exposed to different doses of irradiation and at different times after irradiation

2.3 18β-GA對IR誘導的NIH 3T3活化的影響

2.3.1 Western-blot檢測細胞內α-SMA蛋白表達 照射后細胞內FN和α-SMA蛋白表達增加。與IR組比較，使用18β-GA(20 μmol/L)處理后，照射后NIH 3T3細胞內FN和α-SMA的表達下降，差別有統計學意義(P<0.05，圖4)。

Control：正常對照；IR：照射；GA：18β-甘草次酸；DMSO：二甲基亞砜；α-SMA：α-平滑肌肌動蛋白；NIH 3T3：小鼠胚胎成纖維細胞。A：Western-blot檢測各組細胞中Fibronectin和α-SMA 表達；B：Fibronectin蛋白相對表達量；C：α-SMA蛋白相對表達量。與Control組比較，#：P<0.05；與IR組比較，△：P<0.05。圖4 各組NIH 3T3細胞Fibronectin和α-SMA的蛋白表達Fig.4 Protein expression of Fibronectin and α-SMA in each group of NIH 3T3 cells

2.3.2 免疫熒光檢測細胞內α-SMA表達 免疫熒光結果顯示，輻射可誘導 NIH 3T3細胞大量表達α-SMA。與IR組比較，IR+GA組的平均熒光強度低于IR組，即α-SMA的表達減少，差別有統計學意義(P<0.05，圖5)。

Control：正常對照；IR：照射；GA：18β-甘草次酸；DMSO：二甲基亞砜；NIH 3T3：小鼠胚胎成纖維細胞；α-SMA：α-平滑肌肌動蛋白。A：各組NIH 3T3細胞的α-SMA免疫熒光染色(×200)；B：各組細胞α-SMA的平均熒光強度比較。與Control組比較，#：P<0.05；與IR組比較，△:P<0.05。圖5 各組NIH 3T3細胞α-SMA的免疫熒光染色及熒光強度比較Fig.5 Comparison of immunofluorescence staining and fluorescence intensity of α-SMA in each group of NIH 3T3 cells

2.3.3 膠原凝膠收縮試驗 與Control組比較，IR組的相對凝膠面積縮小；與IR組比較，IR+GA組的相對凝膠面積增大(P<0.05，圖6)。

Control：正常對照；IR：照射；GA：18β-甘草次酸；DMSO：二甲基亞砜；NIH 3T3：小鼠胚胎成纖維細胞。A：凝膠收縮實驗檢測各組NIH 3T3細胞的收縮活性；B：各組NIH 3T3細胞相對凝膠面積百分比。與Control組比較，#：P<0.05；與IR組比較，△：P<0.05。圖6 各組NIH 3T3細胞的收縮活性比較Fig.6 The contractile activity of NIH 3T3 cells in each group

3 討 論

真皮纖維化是電離輻射導致皮膚損傷的最終形式，是進行性和不可逆的，目前仍沒有特效藥物治療。因此，研究放射性皮膚纖維化的分子機制，尋找有效的治療藥物具有重要的意義。已有研究[9-11]證實，18β-GA除了具有抗氧化和抗炎作用外，還具有抗肝纖維化及肺纖維化的作用。課題組前期的研究[7]表明，18β-GA具有減輕急性放射性皮炎的作用，但其是否具有抗皮膚纖維化的作用尚不明確。

本研究使用照射小鼠背部皮膚的方式構建放射性皮膚纖維化模型[12]，與照射小鼠腿部構建的方式[7]比較，這種方式具有以下優勢：(1)構建模型方便，不需要對小鼠腿部進行拉扯和固定。(2)避免了對重要器官和內臟造成的放射損傷。由于在模型中使用的單次照射劑量較大(35 Gy)，在腿部照射的方式中，照射野的微小偏移或小鼠的輕微挪動都有可能造成小鼠腸道組織接受大劑量射線照射，從而導致小鼠的意外死亡。(3)照射區域較大，方便觀察放射損傷和后續分子實驗取材。此外，為成功地開發一種損傷模型，模擬在治療過程中發生在人體皮膚上的組織學和分子變化，必須確定不會造成嚴重急性皮膚損傷的輻射劑量。既往一些放射性皮膚纖維化的研究[13-14]，采用40～50 Gy 照射，可能劑量過高。CHANG等[12]的研究通過比較15～50 Gy 照射后的小鼠皮膚組織學、分子變化(TGF-β、Wnt、β-catenin水平)，發現40和50 Gy照射早在第 2 周就造成潰瘍等比較嚴重的皮膚損傷，而較低的放射劑量可以誘導皮膚纖維化且減少不必要的嚴重急性皮膚損傷，可以更好地模擬發生在人類身上的慢性損傷模式。故本研究使用單次 35 Gy的劑量進行照射。

電離輻射誘導皮膚組織損傷后，啟動了相關的免疫損傷修復。FB被激活后會轉化為MFB，其標記物α-SMA能促進瘢痕收縮，導致放射性皮膚纖維化的發生，所以可用α-SMA的表達量來表征細胞纖維化程度[15-16]。FN是ECM和基底膜中的主要非膠原性糖蛋白。在纖維化過程中，FB及炎癥細胞在FN的作用下不斷被募集、分化、增生，大量生成膠原纖維，導致ECM過度沉積，加快纖維化進程，它可作為ECM合成的檢測指標。ColⅠ是皮膚纖維化的物質基礎，其合成貫穿于整個纖維化形成過程，是纖維化皮膚有別于正常皮膚的重要病理標志。本研究發現：NIH 3T3細胞接受6 Gy X射線照射后48 h內，FN、ColⅠ和α-SMA的表達水平未出現明顯升高，部分指標(FN和α-SMA)的表達甚至出現下降的趨勢，直到照射后72 h才出現明顯升高，標志著FB的活化。本研究結果很好地印證了輻射誘導FB活化的理論，即在受到輻射的早期，FB出現放射損傷的特征，主要表現為細胞活性下降，凋亡比例升高，胞內ROS升高等[17]；之后隨著細胞分泌促修復的因子如TGF-β等，FB才開始表現出活化的特征，驅動纖維化[18]。所以，在輻射誘導的纖維化研究中，細胞模型在接受照射后，應該推遲取樣或檢測的時間點(≥72 h)，這樣更有利于觀察輻射誘導的纖維化特征，而不是放射造成的細胞損傷。

既往研究[9-10]表明，GA 在纖維化疾病中起抑制作用。GA可抑制肝星狀細胞α-SMA 表達和膠原纖維的合成，下調Ⅰ型和Ⅲ型前膠原的mRNA表達，減少Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的沉積而減輕肝纖維化[19]。GA衍生物可以降低TGF-β1刺激的A549細胞內ColⅠ和α-SMA的表達水平，改善小鼠肺部炎癥和纖維化程度[20]。此外，GA可以抑制TGF-β1/Smads信號通路的激活，降低肺組織中TGF-β1、Smad2和Smad3的表達而減輕放射性肺損傷[21]。本研究也發現，18β-GA顯著抑制輻射誘導小鼠皮膚纖維化的程度，維持皮膚組織結構，減少皮膚膠原沉積，抑制FN、ColⅠ和α-SMA的表達。此外，18β-GA可以抑制輻射誘導的NIH 3T3細胞內FN、ColⅠ和α-SMA的表達，減少細胞收縮。這說明18β-GA能夠抑制電離輻射誘導的FB激活、抑制膠原合成、抑制ECM FN的合成分泌，從而發揮減輕放射性皮膚纖維化的作用。由于FB活化后向MFB轉化主要受TGF-β信號通路調控[22]，所以GA抑制FB活化的作用是否與抑制TGF-β信號通路有關，還需后續實驗進一步探討。

綜上所述，18β-GA具有減輕小鼠放射性皮膚纖維化的作用，可能與抑制FB活化有關，但具體作用調節機制尚不清楚，有待更深入的研究，以期能為放射性皮膚纖維化的發生機制和干預措施提供新思路。