球形芽孢桿菌轉(zhuǎn)化豬去氧膽酸為3β-豬去氧膽酸的研究

盛 敏，謝小國，李國軍，鄧家國，歐陽文凱，萬里平，李躍忠

（常德云港生物科技有限公司，湖南 常德 415001）

1 背景介紹

甾體化合物（steroids）也稱類固醇，是一類以環(huán)戊烷多氫菲為母核的化合物，側(cè)鏈上有不同的基團(tuán)。環(huán)戊烷多氫菲母核包含3個(gè)六元環(huán)（A、B、C）和1個(gè)五元環(huán)（D），結(jié)構(gòu)式如圖1所示[1]。幾乎所有甾體化合物母核的第C10和C13位都含有角甲基、伯醇或醛基等，C3、C11、C17位可能連接羥基或酮基，A環(huán)和B環(huán)在不同位置上含有多個(gè)雙鍵，C17位上連接結(jié)構(gòu)不同的側(cè)鏈等[2]。當(dāng)甾體母核上的取代基團(tuán)和雙鍵位置不同時(shí)，甾體的生理活性差異明顯，據(jù)此形成了一系列生理功能各異的甾體化合物。豬去氧膽酸（3α,6α-二羥基膽烷酸，HDCA）是由3個(gè)六元環(huán)、1個(gè)五元環(huán)組成的甾體骨架和1個(gè)脂肪側(cè)鏈共24個(gè)碳原子構(gòu)成的甾體化合物，結(jié)構(gòu)式如圖2所示[3]。

圖1 環(huán)戊烷多氫菲核

圖2 豬去氧膽酸結(jié)構(gòu)式

HDCA經(jīng)由豬膽汁提取、加工制成，具有降血脂、祛痰、鎮(zhèn)咳的作用。HDCA對百日咳桿菌、白喉?xiàng)U菌、金黃色葡萄球菌等有一定的抑制作用，可用作消炎藥，治療慢性支氣管炎、小兒病毒性上呼吸道炎癥等。HDCA還是人工牛黃配方的重要原料，也是清開靈等其他中藥制劑的成分[4]。3β-豬去氧膽酸（3β,6α-二羥基膽烷酸，3β-HDCA）是HDCA的同分異構(gòu)體，在豬膽汁中天然存在，能在HDCA的合成、提取中作為雜質(zhì)影響HDCA的純度。目前，市面上有3β-HDCA出售，可作為標(biāo)準(zhǔn)品使用。3β-HDCA主要通過化學(xué)法合成，由于化學(xué)方法存在污染環(huán)境、合成工藝復(fù)雜等不足，研究人員致力于尋找更加快捷簡便、穩(wěn)定高效并且對環(huán)境友好的甾體化合物（如3β-HDCA）的生產(chǎn)方式，如生物轉(zhuǎn)化法。

生物轉(zhuǎn)化是利用生物體系（包括植物、微生物或動(dòng)物組織的培養(yǎng)體系）或生物體系相關(guān)酶制劑對外源有機(jī)底物某一特定部位或功能基團(tuán)進(jìn)行特異性結(jié)構(gòu)修飾，以獲得有價(jià)值產(chǎn)物的生理、生化反應(yīng)。甾體化合物的微生物轉(zhuǎn)化類型包括氧化、還原、異構(gòu)化、縮合、水解、引入雜原子等反應(yīng)[5]。甾體化合物的微生物轉(zhuǎn)化過程一般由兩個(gè)階段組成：第一階段是培養(yǎng)菌體，以獲得足量的菌體和酶；第二階段是向培養(yǎng)液中加入甾體化合物，完成生物轉(zhuǎn)化的過程[6]。

早有研究表明，HDCA可以作為底物進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化。Owen R W[7]在1983年發(fā)表論文，表明假單胞菌在厭氧條件下可將HDCA轉(zhuǎn)化為6-羥基-3-氧膽-4-烯-24膽烷酸，然而并無相關(guān)文獻(xiàn)或?qū)＠l(fā)現(xiàn)HDCA轉(zhuǎn)化為3β-HDCA的方法。本研究的目的在于通過反復(fù)篩選獲得能對HDCA進(jìn)行轉(zhuǎn)化的菌株，并對其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，證明其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為3β-HDCA。研究內(nèi)容包括針對前期研究篩選獲得球形芽孢桿菌AKU218，并進(jìn)行發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)，以HDCA為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中通過高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）檢測確定能否發(fā)生轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化時(shí)間，提取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，通過與3β-HDCA標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer，LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS）對比分析，證明球形芽孢桿菌AKU218可將HDCA轉(zhuǎn)化為3β-HDCA。

2 材料與方法

2.1 菌種

球形芽孢桿菌AKU218由株式會(huì)社Chitose研究所提供。

2.2 主要試劑

HDCA為常德云港生物科技有限公司產(chǎn)品，純度在98.0%以上，其他試劑均為市售分析純試劑。

2.3 培養(yǎng)基

本研究所用培養(yǎng)基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）、細(xì)菌培養(yǎng)基和無機(jī)鹽培養(yǎng)基，配方如下：（1）PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.00 g/L、葡萄糖20.00 g/L、瓊脂15.00～20.00 g/L，自然pH。（2）細(xì)菌培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.00 g/L、酵母膏5.00 g/L、葡萄糖1.00 g/L、磷酸氫二鉀1.00 g/L。（3）無機(jī)鹽培養(yǎng)基：酵母膏0.25 g/L、磷酸氫二鉀1.00 g/L、磷酸二氫鉀1.00 g/L、硫酸銨1.00 g/L、氯化鈉0.10 g/L、硫酸鎂0.20 g/L、氯化鈣0.02 g/L、硫酸亞鐵0.01 g/L。

2.4 實(shí)驗(yàn)步驟

2.4.1 孢子和種子制備

將配制好的PDA培養(yǎng)基分裝倒入500 mL錐形瓶中，包扎好并標(biāo)明名稱、配制日期和配制人；在滅菌鍋內(nèi)115 ℃滅菌30.00 min，待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右后，無菌操作倒平板（每皿約倒15 mL），室溫平置，待凝后制得PDA平板；用接種環(huán)挑取球形芽孢桿菌AKU218的菌絲體在PDA平板上劃線，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，得到球形芽孢桿菌AKU218平板。

2.4.2 菌種發(fā)酵培養(yǎng)

向玻璃試管中倒入4 mL滅菌后的細(xì)菌培養(yǎng)基，細(xì)菌培養(yǎng)基配方：用接種環(huán)挑取球形芽孢桿菌AKU218的菌絲體接種于細(xì)菌培養(yǎng)基中，在28 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，再將其倒入裝有細(xì)菌培養(yǎng)基的200 mL錐形瓶中，培養(yǎng)24 h后，3 000 r/min離心10.00 min分離回收菌體。

2.4.3 HDCA轉(zhuǎn)化培養(yǎng)

將所得菌體分散于1 000 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方：向培養(yǎng)基中加入5 g HDCA及10.0 μL β-氧化抑制劑2,2’-Bipyridyl，放入有脫氧劑的密閉容器中，于厭氧條件下28 ℃、120 r/min培養(yǎng)36 h。2.4.4 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離提取

過濾發(fā)酵培養(yǎng)液，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取3次。合并萃取有機(jī)相，真空減壓濃縮至干，得轉(zhuǎn)化殘?jiān)?。?0 mg樣品加2 mL甲醇溶解后，流動(dòng)相定容至20 mL，HPLC檢測，對照品用相同方法檢測。

2.4.5 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析

另取2.5 μL乙酸乙酯抽提液與50.0 μL含0.1%脂肪酸分析用熒光試劑ADAM甲醇溶液混合后，再添加47.5 μL甲醇，于室溫下靜置60.00 min，形成熒光標(biāo)記，然后對樣品進(jìn)行HPLC分析。新購入標(biāo)準(zhǔn)樣3β-HDCA用同一方法分析。熒光標(biāo)記后轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS、GC-MS分析。

2.5 分析方法

2.5.1 HPLC分析

本研究將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用流動(dòng)相（色譜純乙腈∶0.1%磷酸溶液=90∶10）復(fù)溶后，用0.22 μm有機(jī)膜過濾除雜，注射器進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC檢測。

2.5.2 LC-MS分析

在LC-MS分析前，需要對樣品進(jìn)行處理，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物熒光標(biāo)記方法如2.4.5所述。熒光標(biāo)記后樣品進(jìn)行LC-MS分析。

2.5.3 GC-MS分析

在GC-MS分析前，需要對樣品進(jìn)行處理，處理方式：（1）甲基酯化反應(yīng)：向1 mg樣品中加入700.0 μL 2N鹽酸甲醇溶液后，添加70.0 μL 2,2-Dimethoxypropane于85 ℃下保溫1 h。反應(yīng)后減壓蒸發(fā)去除溶劑，加入100.0 μL無水甲醇后，再次減壓蒸發(fā)去除溶劑。（2）TMS化反應(yīng)：向甲基酯化反應(yīng)后的樣品中添加600.0 μL pyridine∶BSTFA=2∶1的溶液，于80 ℃下保溫40.00 min。各標(biāo)準(zhǔn)樣處理好后進(jìn)行GC-MS分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 球形芽孢桿菌AKU218轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的確認(rèn)

球形芽孢桿菌AKU218在細(xì)菌培養(yǎng)基中擴(kuò)增后進(jìn)行HDCA轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，在好氧條件下，5.71 min有產(chǎn)物生成；在厭氧條件下，8.44 min左右有產(chǎn)物生成。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)品與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對比確認(rèn)

將球形芽孢桿菌A K U 218的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)樣3β-HDCA對比，HPLC所得保留時(shí)間完全一致。因此，該產(chǎn)物可能為HDCA 3位羥基經(jīng)過脫氫酶的羥基氧化后，再次加氫還原形成的光學(xué)立體結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。

本研究進(jìn)一步通過LC-MS和GC-MS對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，對膽汁酸熒光標(biāo)記后的樣品進(jìn)行LC-MS分析。3β-HDCA標(biāo)準(zhǔn)樣的LC-MS分析結(jié)果表明，在同位體存在的情況下，該化合物以分子質(zhì)量617和619被檢出。GC-MS分析結(jié)果顯示，二者保留時(shí)間一致，MS圖譜也完全一致。因此，該轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可以被確認(rèn)為3位羥基由α轉(zhuǎn)化為β的HDCA光學(xué)異構(gòu)體。由于結(jié)構(gòu)得到確定，該產(chǎn)物無需進(jìn)一步的核磁分析。

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)球形芽孢桿菌AKU218對HDCA有轉(zhuǎn)化作用。通過HPLC分析對比發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物出峰時(shí)間與3β-HDCA標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間一致；后通過LC-MS和GC-MS進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為3β-HDCA。3β-HDCA標(biāo)準(zhǔn)樣通過LC-MS分析以分子質(zhì)量617和619被檢出。GC-MS分析結(jié)果也證明，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與3β-HDCA標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間一致，同時(shí)MS圖譜也完全一致。由于結(jié)構(gòu)得到確定，該產(chǎn)物無需進(jìn)一步的核磁分析。本研究表明，3位羥基經(jīng)過球形芽孢桿菌AKU218脫氫酶的羥基氧化后，再次加氫還原形成光學(xué)立體結(jié)構(gòu)異構(gòu)體3β-HDCA。本研究尚未對球形芽孢桿菌AKU218轉(zhuǎn)化條件對收率的影響進(jìn)行探索，后續(xù)將通過正交試驗(yàn)等方法進(jìn)行培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化，提高轉(zhuǎn)化效率。

熊去氧膽酸（3α,7β-二羥基-5β-膽烷酸，UDCA）是HDCA的同分異構(gòu)體，其殺菌、抗炎和溶解膽汁酸的作用比HDCA強(qiáng)，并且無不良反應(yīng)。因此，臨床上應(yīng)用UDCA治療膽結(jié)石、膽汁淤積性疾病以及脂肪肝、結(jié)腸腫瘤等疾病[8-9]。UDCA也是首個(gè)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療原發(fā)性膽汁性肝硬化的藥物，具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前，有研究表明，HDCA可經(jīng)酯化、選擇性氧化、環(huán)氧化、脫保護(hù)等一系列化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為UDCA[10]，但化學(xué)法工藝煩瑣、流程復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本次研究結(jié)果證明，HDCA可被微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化利用，這可能預(yù)示HDCA存在被微生物轉(zhuǎn)化為UDCA的可能。通過進(jìn)一步擴(kuò)大微生物菌株篩選、考察反應(yīng)條件等方式，有可能篩選出能將HDCA轉(zhuǎn)化為UDCA的菌株。一旦成功，這將是膽汁酸微生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的又一重大發(fā)現(xiàn)，具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。