高效液相色譜法同時測定飼料中5種合成類抗氧化劑含量

商 軍，張浩然，田 愷，華賢輝，徐 汀

（上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103）

飼料在運輸、貯存過程中，不飽和油脂和其他對氧不穩定的物質 （如維生素類）很容易受到破壞，而且這種破壞是一種不可逆的損害。飼料氧化損害會破壞脂溶性維生素和色素，明顯降低飼料蛋白和能量利用效率，增加飼料的毒性產物，也使動物生產性能降低，甚至中毒死亡（李方方等，2020）。在飼料中添加少量或微量的抗氧化劑，可延長飼料的保質期，提高飼料的利用率，有效地避免上述不利因素，為此，抗氧化劑是飼料工業生產中不可缺少的一種添加劑（王杰等，2019；黃濤等，2004）。抗氧化劑可分為合成類和天然類，目前在飼料工業生產中使用的絕大多數為合成類抗氧化劑，作為合成類抗氧化劑允許在飼料中添加使用的有沒食子酸丙酯 （PG）、特丁基對苯二酚（TBHQ）、乙氧基喹啉（EQ）、丁基羥基茴香醚（BHA）和二丁基羥基甲苯（BHT），上述5種合成類抗氧化劑收載于 《飼料添加劑品種目錄》（農業部第2045號公告）中。

由于合成類抗氧化劑過量使用會對人畜產生毒性，為此，在《飼料添加劑安全使用規范》（農業部第2625號公告）中對上述5種合成類抗氧化劑在飼料中使用都有著明確的限量要求。其中，單獨使用時，在配合飼料或全混合日糧中的最高限量分別為PG 100 mg/kg，EQ 150 mg/kg（犬除外，犬為100 mg/kg），BHA、BHT和TBHQ為150 mg/kg；同時使用時，在配合飼料或全混合日糧中的總量不得超過150 mg/kg；單獨或同時在飼用油脂中使用時，總量不得超過200 mg/kg。目前，作為飼料中合成類抗氧化劑的測定標準 （GB/T 17814-2011）中規定了4種合成類抗氧化劑檢測，未將特丁基對苯二酚（TBHQ）列入檢測項目。為此，參考目前國內外相關文獻報道 （胡玉霞，2019；李滿秀等，2015； 李興根等，2012； 蔡發等，2010；Perrin C，2003；Christian等，2002），提出了對該標準的修訂（國家標準項目計劃編號：20193212-T-469），本實驗采用高效液相色譜法同時測定飼料中5種合成類抗氧化劑含量，以增強修訂后標準的適用性和普適性，為《飼料添加劑安全使用規范》中規定上述5種合成類抗氧化劑在飼料中規范合理使用提供檢測技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀（Waters 2695-2998，配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器，美國Waters公司）；色譜工作處理站（EmpowerⅡChem-station，美國Waters公司）；超聲波清洗器（KQ-250DB型，昆山市超聲波儀器有限公司）；乙腈（色譜純，默克公司）；乙酸（色譜純，默克公司）；PG標準品（CAS：121-79-9，含量≥98%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公 司 ）；TBHQ標 準 品（CAS：1948-33-0，含量≥98%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；EQ標準品 （CAS：91-53-2，含量≥95%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；BHA標準品（CAS：25013-16-5，含量≥98%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；BHT標準品（CAS：128-37-0，含量≥98%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；一次性注射器（1、10 mL，山東朱氏藥業集團有限公司）；有機相針式濾器（直徑25 mm，孔徑0.45 μm，美國PALL公司）；有機相微孔濾膜（孔徑0.22 μm，美國PALL公司）；水（符合GB/T 6682一級用水的規定）；樣品（市場抽檢及部分企業提供）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的制備 （1）混合標準儲備溶液：分別準確稱取適量5種抗氧化劑標準品，用乙腈制備成含PG的質量濃度為0.5 mg/mL，含TBHQ、EQ、BHA和BHT的質量濃度為1 mg/mL的混合標準儲備溶液，置于棕色容量瓶中，2～8℃冰箱中保存備用，有效期為2周。（2）混合標準系列工作溶液：準確移取上述混合標準儲備溶液20 mL于200 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻；分別準確移取適量上述溶液，然后用乙腈分別稀釋制備成使PG的質量濃度為0.50、2.00、4.00、8.00、16.0、20.0 μg/mL和25.0 μg/mL，TBHQ、EQ、BHA、BHT的 質 量 濃 度 為1.00、4.00、8.00、16.0、32.0、40.0 μg/mL和50.0 μg/mL的混合標準系列工作溶液。臨用現配。

1.2.2 試樣溶液制備 （1）固體類試樣：準確稱取已粉碎、全部通過0.42 mm孔徑分析篩、已混勻的試樣5 g，置150～250 mL的具塞三角瓶中，準確加入50 mL的乙腈，搖勻，置超聲波清洗器中提取30～40 min，在提取過程中振搖2～3次。放冷至室溫，搖勻。用10 mL注射器吸取上述提取液適量，用有機相針式濾器（直徑25 mm，孔徑0.45 μm）過濾，濾液再經0.22 μm微孔濾膜過濾后備用。供液相色譜測定。（2）動物油脂類試樣：準確稱取5 g油脂，置150～250 mL的具塞三角瓶中（如為凝固狀，置65℃水浴中加熱7 min，使融化），準確加入50 mL的乙腈，置超聲波清洗器中，在55℃的水浴中超聲提取約40 min。冷卻至室溫，取上層液10～20 mL，置離心管中，9000 r/min離心5 min，用10 mL注射器吸取上述離心液適量，用有機相針式濾器（直徑25 mm，孔徑0.45 μm）過濾，濾液再經0.22 μm微孔濾膜過濾后備用。供液相色譜測定。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱：十八烷基鍵合相（C18）柱（長150 mm× 內徑4.6 mm，粒徑5 μm）；進樣體積：20 μL；波長：200～400 nm；檢測波長：280 nm；洗脫方式：等度洗脫；流動相：乙腈-2%乙酸溶液（65+35，V1+V2）；流速：0.5 mL/min；柱溫：20～30℃。

1.2.3 試樣測定 分別取混合標準系列工作溶液和試樣溶液分別按“1.2.3”的液相色譜條件上機測定，以保留時間定性，試樣溶液中抗氧化劑的保留時間與混合標準系列工作溶液中抗氧化劑 （質量濃度相當）的保留時間應一致，其相對偏差在±2.5%之內。以5種抗氧化劑的質量濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。試樣溶液中抗氧化劑的質量濃度應在標準曲線的線性范圍內。如超出標準曲線的線性范圍，應將試樣溶液用乙腈稀釋后，重新測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長的選擇 取混合標準系列工作溶液進行檢測波長的選擇，采用二極管陣列檢測器在波長200～400 nm內進行紫外掃描，提取相應紫外光譜圖，結果見圖1。結果表明，5種抗氧化劑在波長在200～400 nm均有2處最大紫外吸收波長，其中在220 nm波長附近處均有最大吸收，其他最大吸收波長處又各不相同。由于飼料試樣基質較為復雜，選擇已接近紫外末端吸收的220 nm波長附近處作為檢測波長，會對5種抗氧化劑的測定產生較大的干擾。為使測定過程中5種抗氧化劑均能得到較好的響應值 （峰面積），分別在230、250、280 nm和310 nm波長處 分別提取相應色譜圖，結果見圖2。結果表明，在230 nm波長處提取的色譜圖，溶劑峰的響應值較待測5種抗氧化劑峰的響應值大；在250 nm波長處，TBHQ峰和BHT峰的響應值太小；在310 nm波長處，BHT峰沒有響應；在280 nm波長處，5種抗氧化劑的峰面積均最為適宜。本文選擇280 nm作為5種抗氧化劑的檢測波長。

圖1 5種抗氧化劑在波長200～400 nm內紫外掃描圖

圖2 5種抗氧化劑在不同波長處的提取色譜圖

2.1.2 流動相的選擇與優化 本文采用等度洗脫方式，分別考察了不同流動相組成（甲醇-甲酸、乙醇-乙酸和乙腈-乙酸）對飼料中5種抗氧化劑測定的影響，經實驗表明，采用乙腈-乙酸組成的流動相，5種抗氧化劑在不同品牌的C18柱上均能得到滿意的色譜性能。為確保本方法的適用性，以5種抗氧化劑均應符合色譜峰的保留時間 （t）3≤t≤30和色譜峰間的分離度（R）≥1.5作為優化指標。取混合標準系列工作溶液和添加5種抗氧化劑的試樣溶液分別對乙腈-乙酸流動相組成的配比進行了優化選擇。實驗結果表明，當流動相中乙腈的比例為65%時，5種抗氧化劑的色譜峰均能完全分離（R≥1.5），最先洗脫出的PG色譜峰的保留時間約為3.9 min，最后洗脫出的BHT色譜峰的保留時間約為25.5 min，保留時間也均在3≤t≤30范圍內。當選擇乙酸溶液濃度為2%（V/V）時，5種抗氧化劑色譜峰保留時間的重復性和色譜峰形均良好。本文選擇了乙腈-2%乙酸溶液（65+35，V1+V2）組成的流動相。優化結果見圖3。

圖3 流動相和流速優化后5種抗氧化劑的典型色譜圖

2.1.3 流速的優化 以優化后的流動相，分別設定流速為0.5、0.6、0.8 mL/min和1.0mL/min來考察對5種抗氧化劑的t和R的影響，為確保本方法的適用性，以5種抗氧化劑均應符合色譜峰的保留時間（t）3≤t≤30和色譜峰間的分離度 （R）≥1.5作為優化指標。取混合標準系列工作溶液和添加5種抗氧化劑的試樣溶液分別對流速進行了優化選擇。實驗結果表明，當流速為0.5 mL/min時，5種抗氧化劑的色譜峰均能完全分離（R≥1.5），保留時間均為3≤t≤30。本文選擇流速為0.5 mL/min。優化結果見圖3。

2.2 預處理方法的選擇

2.2.1 固體類試樣 根據相關文獻的報道 （黃彪等，2018； 楊春林等，2013； 鐘偉燕等，2012；Saad等，2007），測定樣品中抗氧化劑含量的提取方法主要有層析柱法、液液萃取法、固相萃取法、超聲波輔助有機溶劑直接提取法等。層析柱法因層析柱填充的效率差異而影響測定結果的重復性，操作耗時較長，不適合大批量樣品的處理；液液萃取法雖處理方法簡單，但回收率相對較低，不適合大批量樣品的處理；固相萃取法具有有機溶劑消耗少、分離效果好、操作簡單、便于自動化的優點，缺點是順序操作，針對不同基質的樣品會導致不同步驟的優化復雜，甚至不能優化；超聲波輔助有機溶劑直接提取法不需專用設備，提取效率較高，適合大批量樣品的處理。根據飼料樣品的性質，選擇了乙腈為提取有機溶劑，選用了超聲波輔助有機溶劑直接提取法，按“1.2.2”試樣溶液制備分別對加標的不同基質飼料試樣進行了提取處理，試驗結果見“2.3.3”的加標回收率實驗。結果表明，采用乙腈為提取有機溶劑，超聲水浴助溶40 min，提取液經有機相針式濾器（直徑：25 mm，孔徑：0.45 μm）過濾，實現提取，上述提取方法適用于固體類飼料試樣中5種抗氧劑的測定。

2.2.2 動物油脂類試樣 部分動物油脂，如牛油，常溫下為凝固狀態，因此在用乙腈提取之前，需要將其融化。5 g油脂在融化狀態下，加入50 mL乙腈后，常溫超聲提取，會出現重新凝固的現象。因此，需要在一定溫度下進行超聲提取。根據40～65℃下超聲提取的現象，發現超聲溫度設置為55℃時，能夠避免油重新凝固，乙腈和融化狀態的油脂能夠充分接觸。此外，為考察55℃超聲40 min對各組分的影響，將50 mL的混合標準作同步處理，和未超聲處理的等濃度混合標準液峰面積相比，處理后的各組分峰面積的回收率為98.7%～101.4%。因此，選擇超聲提取溫度為55℃，以保證油脂樣品中抗氧化劑的充分提取。55℃超聲提取后，試樣溶液溫熱，如直接取上層過濾膜，會出現渾濁現象，因此需要靜置10 min以上。為提高效率，取上層液10～20 mL，置離心管中，9000 r/min離心5 min，用有機相針式濾器（直徑25 mm，孔徑0.45 μm）過濾，實現提取。實驗結果見“2.3.3”的加標回收率實驗。結果表明，上述提取方法適用于動物油脂類試樣中5種抗氧劑的測定。

2.3 方法的確認

2.3.1 線性關系 按“1.2.3”的液相色譜條件，取混合標準系列工作溶液進行液相色譜分析，每個濃度進樣3次。以5種抗氧化劑色譜峰的峰面積為縱坐標，標準系列工作溶液的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。結果表明，PG在質量濃度0.50～25.00 μg/mL，BHA、EQ、TBHQ和BHT在質 量濃度1.00～50.00 μg/mL均與峰面積呈良好的線性關系（相關系數r2＞0.999）。結果見圖4。

圖4 混合標準（PG、TBHQ、BHA、EQ和BHT）系列工作溶液的線性關系圖

2.3.2 檢出限（LOD）和定量限（LOQ） 選取空白基質飼料，添加一定濃度的5種抗氧化劑標準溶液，按“1.2.2”的試樣溶液制備，“1.2.3”的液相色譜條件進行測定。依據設定5種抗氧化劑的LOD為信噪比（S/N）=3，LOQ為信噪比（S/N）=10。 經實驗，確定了本方法的檢出限分別為：PG 1.8 mg/kg、BHA 1.9 mg/kg、EQ 2.0 mg/kg、TBHQ 1.9 mg/kg、BHT 5.0 mg/kg；本方法的定量限分別為：PG 8.8 mg/kg、BHA 8.7 mg/kg、EQ 8.9 mg/kg、TBHQ 8.6 mg/kg、BHT 10.0 mg/kg。 結果見圖5。

圖5 LOD和LOQ確定的典型色譜圖

2.3.3 加標回收率與精密度 分別準確稱取配合飼料、維生素添加劑預混合飼料、魚粉、牛油約5 g，根據5種抗氧化劑的線性范圍，依低、中、高分別加入3個濃度水平的5種抗氧化劑混合標準溶液各5份，按“1.2.2”制備成試樣溶液，進行5種抗氧化劑的質量濃度測定。考慮到樣品中存在一定本底，不是理想的空白基質，因此，針對不同本底進行了相應組分的低、中、高濃度添加，調整稀釋倍數，使加標試樣溶液中抗氧化劑的質量濃度在標準曲線的線性范圍內，扣除本底后分別計算添加試樣中的平均回收率和相對標準偏差（RSD）。結果見表1和圖6。結果表明，在不同基質飼料的加標試樣中PG的平均回收率為76.2%～98.8%（RSD 1.1%～9.6%）；TBHQ的平均回收率為77.2%～97.8%（RSD 0.9%～4.3%）；EQ的平均回收率為77.3%～98.0%（RSD 0.7%～6.9%）；BHA的平均回收率為76.7%～95.8%（RSD 1.1%～6.2%）；BHT的平均回收率為75.3%～95.8%（RSD 0.9%～7.1%）。由上述實驗結果可知，方法準確可靠。

圖6 配合飼料、維生素添加劑預混合飼料、魚粉和牛油分別添加低、中、高3個濃度水平的混合標準后的典型色譜圖

表1 不同基質飼料的加標回收率與精密度測定結果（n=5）

2.4 試樣測定 分別取骨粉、魚粉、雞肉粉、雞油、牛油、仔豬前期濃縮飼料、育肥豬配合飼料、4%母豬哺乳期復合預混合飼料、0.3%肉種雞復合預混合飼料和寵物維生素預混合飼料各3份，按“1.2”的實驗方法進行測定，結果見表2。結果表明，上述飼料樣品中抗氧化劑檢出的有TBHQ、EQ、BHA和BHT，其中仔豬前期濃縮飼料和牛油中檢出TBHQ，骨粉、魚粉和雞肉粉中檢出EQ，雞油、4%母豬哺乳期復合預混合飼料和寵物維生素預混合飼料中檢出BHA，牛油、育肥豬配合飼料、0.3%肉種雞復合預混合飼料和寵物維生素預混合飼料中檢出BHT。在魚粉和寵物維生素預混合飼料中添加復合抗氧化劑，從測定結果可知目前飼料工業中主要使用的合成類抗氧化劑為EQ、BHA和BHT。

表2 試樣中合成類抗氧化劑的測定結果（n=3）

3 結論

實驗結果表明，本法操作簡便易行、快速，準確性、重復性均較好，各項性能指標達到日常檢測分析的要求，適用于飼料中PG、TBHQ、EQ、BHA和BHT5種合成類抗氧化劑含量測定的質量控制。