改良清肺顆粒的穩定性研究

薛沾枚， 張 艷， 劉雪松， 郝敬友， 蘇 景， 唐 偉，劉彥凱， 孫洪杰， 徐 麗， 張 備， 史同瑞*

（1.黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江齊齊哈爾 161005；2.哈爾濱綠達生動物藥業有限公司，黑龍江哈爾濱 150039；3.黑龍江省動物疫病控制中心，黑龍江哈爾濱 150069）

呼吸系統疾病能夠引起畜禽機體免疫力低下繼而容易觸發其他傳染病的發生，常伴有咳嗽、氣喘、呼氣困難等癥狀，重則導致死亡，患病動物生產性能下降、養殖成本增高、經濟效益減少（孟賢蕾，2020）。治療畜禽由細菌感染所引發的呼吸系統疾病時，常使用抗生素，但易產生抗生素耐藥性并造成動物體內藥物殘留；病毒性呼吸系統疾病常以預防為主，但常伴隨細菌和寄生蟲等的繼發感染，提升高發病率和高死亡率（朱明霞，2016）。因此，開發具有抗呼吸道病原、副作用小的中草藥替代品具有重要的意義（王玉芳，2016）。改良清肺顆粒方劑是由板藍根、浙貝母、甘草、葶藶子、桔梗組成，經發酵、水提煎煮、濃縮、干燥制粒等工藝而成，具有化痰止咳的功效。顆粒劑便于用藥，能夠最大的發揮藥效（Zhang，2021）。為保證藥物在生產、貯存、運輸中的質量，控制顆粒劑的穩定性是控制質量的重要部分，不僅能保留方劑中藥物有效成分使其充分發揮藥物療效，又能確保臨床應用的療效性（劉錦泉，2012）。本試驗對濕法制粒而成的改良清肺顆粒進行穩定性試驗，為其在生產、運輸、貯藏及使用上提供理論支持和科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗藥物及試劑 改良清肺顆粒，以板藍根、浙貝母、甘草、葶藶子、桔梗為處方（批號分別為20200415，20200416，20200417），由哈爾濱綠達生動物藥業有限公司研制；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷 （批號：20083104），購自成都普菲德生物技術有限公司；石油醚、乙酸乙酯，購自北京迪科馬科技有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

1.1.2 試驗儀器 高效液相色譜儀（LC-20AT，RF-20A）、InertSustain C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm），購自島津（中國）有限公司；漩渦振蕩器（VortexQL902），購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子分析天平（MS104TS/02），購自梅特勒-托利多（上海）有限公司；隔膜真空泵（GM-0.33A），購自天津市津騰實驗設備有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，購自上海旭冠電子科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 薄層色譜鑒別 取改良清肺顆粒1 g，加入70%甲醇20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液作為供試品溶液。取改良清肺顆粒陰性樣品顆粒，制備方法同上。取葶藶子對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品，加甲醇制成1 mL含0.5 mg的溶液作為對照品溶液。再吸取上述溶液5 μL，點于聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯:甲醇:水（7:2:1）為展開劑，2%三氯化鋁為顯色劑，熱風吹干，置于365 nm紫外燈下觀察。

1.2.2 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量測定

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱為InertSustain C18，流動相為甲醇∶0.02%磷酸＝7∶93， 流速為1.0 mL/min，柱溫為25℃，檢測波長為245 nm，進樣量為10 μL。

1.2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取2 mg槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品，放入50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，充分搖勻，制備成濃度為40 μg/mL的對照品溶液。

1.2.2.3 供試品溶液制備 稱取適量顆粒劑樣品，甲醇溶解，超聲處理30 min，10000 r/min離心6 min，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.2.2.4 線性關系考察 精密稱取對照品溶液移置容量瓶中，甲醇定容，制成1 mL含對照品2.5、5、10、20、40 μg的溶液，上樣量10 μL，在上述色譜條件下測定峰面積，以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2.5 精密度試驗 精密量取對照品配制濃度為40 μg/mL的溶液，上樣量10 μL，在上述色譜條件下測定峰面積，連續上樣6次，計算相對標準標準差（RSD）。

1.2.2.6 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，在上述色譜條件下，分別間隔2 h進樣，共測定12個時間點，測定峰面積，計算RSD值。

1.2.2.7 重復性試驗 取同一批供試品溶液，連續制備6份，在上述色譜條件下，測定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷平均含量，計算RSD值。

1.2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取己知含量提取液，共6份，分別精密加入槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品適量，分別進樣l0 μL，計算樣品的加樣回收率。

1.2.3 水分檢測 根據2020版《中國獸藥典》（四部）通則0832水分檢測法中烘干法測定水分，顆粒劑水分規≤8%（中國獸藥典委員會，2020）。

1.2.4 粒度檢測 根據2020版《中國獸藥典》（四部）通則0982粒度檢測法中雙篩法測定粒度，顆粒劑粒度項下規定≤15%。

1.2.5 溶化性檢測 根據2020版 《中國獸藥典》（四部）通則0104檢測溶化性，顆粒劑溶化性項下規定以顆粒劑5 min內全部溶化，肉眼觀察無雜質無異物為符合標準。

1.2.6 影響因素試驗

1.2.6.1 光照試驗 隨機選取3個不同批次的改良清肺顆粒成品，去除包裝，適量均等稱取，平鋪置于培養皿內密閉容器中，將穩定性檢測箱光源強度設置為（4500±500）lx，于第0、5、10天同一時間段，根據2020年版《中國獸藥典》顆粒劑項檢查。

1.2.6.2 高溫試驗 隨機選取3個不同批次的改良清肺顆粒成品，去除包裝，適量均等稱取，平鋪置于培養皿內密閉容器中，置于60℃環境下，于第0、5、10天同一時間段，根據2020年版《中國獸藥典》顆粒劑項檢查。

1.2.6.3 高濕試驗 隨機選取3個不同批次的改良清肺顆粒成品，去除包裝，適量均等稱取，平鋪置于培養皿內密閉容器中，放置在NaCl飽和液飽和的干燥器中（濕度為74%），于第0、5、10天同一時間段，根據2020年版《中國獸藥典》顆粒劑項檢查。

1.2.7 加速穩定性試驗 隨機選取將3批不同批次的改良清肺顆粒成品，裝入鋁箔袋，密封包裝，放置于溫度為40℃，濕度為（75±5）%的恒溫培養箱中， 放置6個月， 分別于第0、1、2、3、6個月取樣，根據2020版《中國獸藥典》顆粒劑項下要求檢測性狀、鑒別、粒度、水分、溶化性和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量。第0個月之后取樣與其進行對比檢測。

1.2.8 長期穩定性試驗 將3批不同批次的改良清肺顆粒成品，裝入鋁箔袋，密封包裝，放置于溫度為（25±2）℃，相對濕度為（60±10）%的條件下，放置12個月，每個月相同時間取樣，根據2015版《中國獸藥典》顆粒劑項下檢測性狀、鑒別、粒度、水分、溶化性和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量情況。第0個月之后取樣與其進行對比檢測。

1.3 統計與分析 用Graphpad Prism 6.0軟件進行統計分析，通過單因素方差進行差異顯著性檢驗。結果以“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 薄層色譜 置紫外燈（254 nm）下視檢。供試品色譜中與槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品和南葶藶子對照藥材色譜位置相同，顯相同的淺紫紅色斑點，陰性對照無干擾。詳細結果見圖1。

圖1 改良清肺顆粒薄層色譜圖

2.2 方法學研究

2.2.1 線性關系考察 經測定得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品標準曲線為y＝22074x-33975（R2＝0.9999），結果表明，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量在2.5～40 μg/mL內線性關系良好（圖2、圖3）。

圖2 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷標準曲線

圖3 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷標準品液相色譜圖

2.2.2 精密度考察 連續6次進樣，記錄峰面積。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品峰面積的RSD為0.74%，結果表明，建立測定方法的精密度良好。

2.2.3 穩定性考察 在24 h內連續進樣測定，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量RSD為0.65%，表明供試品溶液在室溫條件下，24 h內穩定性良好。

2.2.4 重復性考察 重復測定的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷平均含量為4.50 mg/L，RSD為0.69%，表明測定方法的重復性良好。

2.2.5 加樣回收率考察 結果見表1，平均回收率為98.53%，RSD為0.50%（n＝6），表明方法的準確性良好。

表1 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷加樣回收率試驗結果

2.3 影響因素試驗結果

2.3.1 光照對改良清肺顆粒穩定性影響 將改良清肺顆粒放置在（4500±500）lx光照強度下照射，于第5、10天后經肉眼觀察外觀性狀未發現明顯變化，顏色為棕黃色，經口味苦。放置第5天和第10天后水分及粒度檢測無明顯變化，較第0天相比水分有所增加但符合規定。放置第5、10天后取樣槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量無明顯變化（P＞0.05），結果表明光照環境對改良清肺顆粒的性狀、水分、粒度、溶化性、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量影響不明顯（表2）。

表2 光照對改良清肺顆粒穩定性的影響結果（n=3）

2.3.2 高溫對改良清肺顆粒穩定性影響 將改良清肺顆粒放置在60℃環境下，于第5天后經肉眼觀察外觀性狀未發現明顯變化，顏色為棕黃色，經口味苦，10 d后觀察顏色較之前比顏色偏淺，經口味苦。隨著時間增加第10天后與最初相比水分減少0.52%（P＜0.05），粒度無明顯變化，顆粒劑中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量降低9%（P＜0.05）（表3）。

表3 高溫對改良清肺顆粒穩定性的影響結果（n=3）

2.3.3 高濕對改良清肺顆粒穩定性影響 將改良清肺顆粒放置在NaCl飽和液飽和的干燥器中（濕度為74%），于第5天經觀察外觀性狀未發生明顯變化，顏色為棕黃色，經口味苦。放置第10天后顏色變深為棕褐色，經口味苦。隨著時間的增加放置第5天與第0天相比水分含量、粒度及槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量差異顯著，水分提高5.23%，含量降低0.9%（P＜0.05）；第10天后水分與第0天相比水分提高19.37%（P＜0.01），粒度和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量分別降低9.3%和3%（P＜0.05），溶化性較第0天相比逐漸變差但符合規定。結果表明高濕環境對改良清肺顆粒的水分含量影響極大，對粒度和顆粒劑中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量有顯著影響，對溶化性影響不明顯（表4）。

表4 高濕對改良清肺顆粒穩定性的影響結果（n=3）

2.4 加速試驗結果 將改良清肺顆粒在溫度為（40±2）℃，濕度為（75±5）%環境中放置6個月，于第1、2、3、4、5、6月后取樣檢測，外觀觀察顆粒劑顏色、水分含量、粒度、溶化性、含量均未發生明顯變化，各項指標均符合規定，表明顆粒劑穩定性良好。

2.5 長期試驗結果 將改良清肺顆粒放置室溫貯存12個月，于每個月同一時間取樣檢測，外觀觀察顏色無明顯變化，顏色為棕黃色味苦，水分含量、粒度、溶化性、含量均未發生明顯變化，各項指標均符合規定，表明顆粒劑穩定性良好。

3 討論

3.1 改良清肺顆粒的含量測定 中草藥顆粒劑為中草藥湯劑基礎上發展起來的常用中草藥劑型，其優點是便于攜帶、運輸、貯藏（郭靜，2020）。中草藥提取物的成分復雜，大多數為親水成分，因此穩定性研究是顆粒劑研發與生產中的關鍵部分（曾春姣，2019）。中草藥顆粒劑如果貯藏不當會發生吸潮、沉淀、變質等現象，對藥物的有效成分及含量造成影響，導致藥物極易失效，從而產生毒副作用影響臨床應用效果（謝平，2020）。中草藥顆粒劑質量可控是中草藥制劑研究的根本要求，但通常存在藥物不穩定性的問題，這也是限制中草藥制劑發展的主要原因之一（郎吉瑞，2020）。本試驗根據 “獸用中藥、天然藥物制劑研究技術指導原則”對改良清肺顆粒的有效含量進行研究，改良清肺顆粒為中成藥，由板藍根、浙貝母、甘草、葶藶子、桔梗5味藥組成，葶藶子為清肺處方藥劑中的“君藥”，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷為葶藶子提取物中主要有效成分之一，含量高，具有專屬性。為保證改良清肺顆粒藥物穩定性，本試驗選取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量進行檢測 （劉冬菊，2020；李玉平，2012）。

3.2 環境對改良清肺顆粒穩定性的影響 影響因素試驗能夠檢測出對顆粒劑藥物穩定性影響的環境條件，使藥物能夠更合理的貯存及包裝。萬壽菊顆粒穩定性研究結果表明在儲存中應避免高溫、光照、堿、酸（楊云裳，2009）。本研究選取光照、高溫、高濕三種因素進行顆粒劑穩定性考察 （李玥，2019）。結果表明，高濕是影響改良清肺顆粒的重要因素，將改良清肺顆粒放置在濕度75%的環境下，放置5 d和10 d后，經檢查水分含量均超過了8%，粒度超過了15%，可見濕度對顆粒的穩定性影響較大，因此改良清肺顆粒適宜在低濕度環境中保存（周曉霞，2011）。

3.3 時間對改良清肺顆粒穩定性的影響 為研究改良清肺顆粒的長期貯存的穩定性及適宜保存期，對改良清肺顆粒進行加速試驗和長期試驗（周曉霞，2011）。在為期6個月的加速試驗中，外觀顏色始終為棕黃色，顆粒流動性良好，經檢測水分含量、粒度、溶化性均符合2015版《中國藥典》顆粒劑項標準，改良清肺顆粒中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量未發生明顯變化，表明改良清肺顆粒的穩定性良好。在為期12個月的長期試驗中，每間隔一個月進行檢測，顆粒劑的流動性相比較好，未發現顆粒劑有凝結粘連現象，水分含量未發生明顯增加，粒度、溶化性良好，顆粒劑中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量未發生明顯變化 （杜宇，2019）。因此，貯存時間對改良清肺顆粒穩定性影響較小（劉廣義，2019）。

4 結論

改良清肺顆粒是顏色為棕黃色，經口味苦的固體顆粒劑，顆粒劑中藥物含量穩定，水分含量、粒度、溶化性均符合2015版《中國藥典》，室溫貯存12個月未見明顯變化，但在貯存過程中應注意避免高濕對改良清肺顆粒穩定性的影響。