小米多糖的提取及抑菌作用研究

趙建英，張森虎，李艷松，李 詳，白 建

（呂梁學院生命科學系，山西呂梁 033001）

小米有很高的營養價值，常被用來制作各種養生粥，還可以用來發酵釀酒，因此對小米多糖的工藝提取可以開發出新的營養豐富且健康的食品（Yang等，2021）。 高晶晶等（2020）研究表明，小米多糖具有一定的抗氧化性，其質量濃度與抗氧化性成正比。王璽等（2016）研究表明，多糖提取率與液固比成正相關，增大液固比，多糖能夠有效的融到溶液中，提高多糖提取率。劉丹丹等（2019）研究表明，多糖可以抑制細菌的生長，對革蘭氏染色為紫色的抑菌效果最好。宋樂園（2020）通過對紅小米多糖提取研究后，得出了紅小米多糖的最佳提取條件。路志芳等（2017）研究表明，植物多糖可以廣泛應用于醫療行業和食品保健領域等，目前已經利用植物多糖研發出一些醫療藥品，治療病毒感染和腫瘤，改善人體的免疫功能，預防心血管疾病等，比如香菇多糖的應用。Wang等（2019）研究表明，原位葡聚糖生產改變了小米的營養價值，導致游離酚類含量和抗氧化活性增加。已有的研究發現HSP-3可作為功能性食品中的活性成分（Huo等，2020；Sharma等，2019）。

本研究以沁州小米為主要原料，按單因素試驗，選出提取時間、提取溫度、料液比三個因素進行響應面試驗（高濤等，2020），確定小米多糖最佳提取條件。對提取出的小米多糖采用濾紙片法（Xu等，2020；Li等，2019）進行抑菌研究，測定其對供試菌的抑菌效果，確定最低抑菌濃度。并研究不同溫度和pH對小米多糖抑菌能力的影響，為小米多糖的開發利用提供理論依據和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 沁州小米采購于呂梁星瑪客超市，酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、苯酚、牛肉膏、氯化鈉、蛋白胨、瓊脂等均是分析純，供試菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）由呂梁學院微生物實驗室提供。

1.2 主要儀器HH系列數顯恒溫水浴鍋：上海禾汽玻璃儀器有限公司；SC-04低速離心機：張家港市騰鷹機械制造有限公司；FA114A電子秤：廣東豪晟科學儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：河南省泰斯特儀器有限公司；UV-1601紫外分光光度計：青島聚創華業分析儀器有限公司；101-00AB恒溫鼓風干燥箱：邢臺鉅都科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小米預處理 將沁州小米置于60℃恒溫干燥箱中，干燥40 min。

1.3.2 小米多糖提取 取5 g小米放入燒杯中，加入100 mL蒸餾水，將燒杯放入恒溫水浴鍋中，在80℃下浸提2 h，取出提取液用濾紙進行過濾，然后將濾液用低速離心機3900 r/min離心25 min，然后取上清液，加入60 mL 95%乙醇，再3900 r/min離心20 min，然后過濾，得到小米粗多糖（諸愛士等，2019），溶解沉淀并定容，取15 mL溶液與燒杯中，然后加鹽酸溶液2 mL，置于60℃水浴鍋中加熱20 min，靜置冷卻，然后滴一滴酚酞試劑，用2 mL 2 mol/mL的氫氧化鈉溶液滴定至淡紅色，將溶液倒入50 mL容量瓶中，搖勻得到小米多糖溶液，用3，5二硝基-水楊酸法（王明瑞等，2020）檢測多糖的含量，以此計算小米多糖提取率。

1.3.3 DNS試劑配制 稱取3，5-二硝基水楊酸3.15 g，酒石酸鉀鈉91.0 g，苯酚2.50 g和無水亞硫酸鈉2.50 g，采用詹夢濤等（2020）的方法配制DNS試劑。配制完成后，放置在棕色瓶中避光儲存，室溫下存放一周后使用。

1.3.4 葡萄糖標準曲線的繪制 根據羅春萍等（2021）的方法配制葡萄糖標準溶液。分別取葡萄糖 標 準 液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL和1.60mL于5mL比色管中，用蒸餾水補至2.50mL，滴加DNS試劑2 mL，100℃加熱10 min，然后靜置冷卻，在波長為540 nm處進行檢測，讀出吸光度值。繪制葡萄糖溶液的標準曲線。

1.3.5 小米多糖含量的測定 取2 mL小米多糖溶液于25 mL具塞試管中，加入2 mL DNS試劑，加熱一段時間，然后靜置冷卻，加入10 mL蒸餾水，對照組用蒸餾水，然后在540 nm波長處進行檢測，讀出吸光度值，計算出小米多糖的提取率（張小貝等，2017）。小米多糖提取率的計算公式：φ＝（（ρ-V）×0.9）/m×100。

1.4 單因素試驗 由預試驗得到提取時間為2 h，提取溫度為80℃，液料比為20：1，多糖提取率最高達3.27%。分別改變提取時間（1、1.5、2、2.5、3 h），提取溫度（70、75、80、85、90℃），料液比（10：1、15：1、20：1、25：1、30：1），以此進行小米多糖的提取。

1.5 響應面優化試驗 利用單因素試驗得出的數據，進行BBD響應面法試驗（張環宇等，2020），以提取時間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）作為三個影響因素，以小米多糖提取率為考察指標。響應面分析因素與水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平

1.6 小米多糖抑菌試驗

1.6.1 牛肉膏蛋白胨培養基的制作 采用湯強等（2018）的方法配制牛肉膏蛋白胨培養基，在無菌環境下操作。

1.6.2 菌懸液的制備 取10 mL的蒸餾水于試管中，用酒精燈加熱，在酒精燈旁冷卻后倒入接種管中，塞上棉塞，搖晃7～9次，然后倒入試管中，備用。

1.6.3 抑菌圈的測定 把濾紙用打孔器做成直徑為6 mm大小的形狀，在培養皿中加入5 mL過濾后的小米多糖提取液，充分浸泡1 h后，用酒精燈灼燒鑷子，待冷卻后用鑷子將濾紙貼在培養基上，然后放在37℃培養箱中培養1 d。用無菌水為對照組，測量抑菌圈的直徑大小，試驗進行3次，取中間值（李世杰等，2018）。配制10 mg/mL的青霉素鈉溶液為陽性對照（許海燕等，2020）。

1.6.4 小米多糖最低抑菌濃度的測定 用二倍肉湯稀釋法（毛暢思等，2021）測定小米多糖提取液的最低抑菌濃度（MIC），小米多糖提取液用無菌水連續稀釋最終質量濃度為0、0.1427、0.2854、0.5708、1.1416、2.2832、4.5664、9.1328 mg/mL， 在37℃恒溫培養箱培育24～36 h后，當試管中沒有菌落生長時，以測定最小抑菌濃度。

1.6.5 不同溫度對小米多糖抑菌能力的影響 將提取出的小米多糖均分為5份，放入燒杯中，在恒溫條件下將小米多糖提取液的溫度調為20、50、80、100、130℃，并恒溫加熱30 min，以無菌水為對照組，然后用濾紙片法對3種供試菌的抑菌效果進行測定，平行3次試驗（唐志凌等，2021；高晶晶等，2020）。

1.6.6 不同pH對小米多糖抑菌能力的影響 將提取出的小米多糖均分為5份，利用1 mol/L的鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉溶液將小米多糖提取液的pH調為1、4、7、10、13， 以無菌水為對照組，然后用濾紙片法對3種供試菌的抑菌效果進行測定，平行3次試驗 （吳孔陽等，2021；劉永永等，2021；吳孔陽等，2020）。

1.7 數據處理 所有的基礎數據都在Microsoft Excel 2010中歸納整理，單因素試驗作圖利用Graphpad Prism8.0，利用Design-ExPert 11軟件對Box-Behnken（BBD）響應面試驗進行分析，最后使用Adobe Photoshop CC 2021對所得的所有圖片進行修飾。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線 由圖1可知，標準曲線的線性回歸方程為：Y＝0.6157X－0.0712，R2＝0.984。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 提取時間對小米多糖提取率的影響 圖2表明，在提取1～2 h時，小米提取率從1.26%增長到2.86%，提取時間增加后，提取率又開始降低。這是因為用熱水浸提時，小米在一段時間后才能破壞細胞壁，而多糖要溶解在溶液中也需要一定的時間，一定時間浸提后，更多的多糖溶解到溶液中，而提取時間太長，會使的多糖在高溫下發生糖酵解，穩定性降低，所以小米多糖最佳提取時間為2 h。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響

2.2.2 提取溫度對小米多糖提取率的影響 由圖3可以看出，在溫度為70～80℃時，隨著溫度的升高，多糖提取率升高，在80℃后，多糖提取率下降，這是因為熱處理可以破壞小米細胞，使多糖溶解在水中，溫度升高會提高物質的擴散系數，加快溶解。在一定的時間內使多糖提取率增加，但過高的溫度會使多糖變性，而使多糖提取率減少。因此，小米多糖的最佳提取溫度為80℃。

圖3 提取溫度對多糖提取率的影響

2.2.3 料液比對小米多糖提取率的影響 從圖4可以看出，料液比可改變溶液的濃度以及溶液黏度等，當料液比的比例變大時，溶液中多糖的濃度降低，多糖提取率增大。但當料液比的比例太大時，溶解速度過快，多糖提取變得困難，增加了損耗，導致多糖損失。由圖4可以看出，當料液比增大時，多糖提取率快速增加，而料液比再變大后，多糖提取率反而降低。因此，當料液比為20：1時，小米多糖提取量最多。

圖4 料液比對多糖提取率的影響

2.3 響應面優化結果

2.3.1 響應面試驗結果分析 運用Design-Expert 11軟件對表1和表2中的數據進行多元回歸擬合，并進行模型優化，得到回歸方程：Y＝3.04+0.1963A+0.0510B—0.0890C—0.0438AB+0.0413AC+0.0317BC-0.4989A2-0.2054B2-0.2919C2。

表2 試驗設計和結果

對模型的顯著性進行檢驗，由表3可知，響應面模型P＜0.0001，表明擬合檢驗極顯著，失擬檢驗P＝0.9814＞0.05，表明失擬項不顯著，這說明方程模擬比較好，可以用該模型進行預測。

由表3可以看出，相關系數R2＝0.9957，表明模型顯著。校正系數R2Adj＝0.9901，說明該模型只有0.99%無法解釋。兩個差值小于0.2，說明具有一致性，模型與實際情況擬合很好。變異系數CV＝1.42%，模型可靠，可以較好地反映真實試驗值，所選用的二次多項模型有效。

對模型的各系數顯著性檢驗分析可知 （表3），因素A、B、C表現為極顯著；交互項AB表現為顯著，AC、BC表現為不顯著， 二次線A2、B2、C2表現為極顯著。該模型中的F值可以看出三個因素對多糖提取率都有非常顯著的影響，其中A、B、C的值分別為230.03、15.53、47.31，所以可以得出A、B、C對多糖提取率的影響力由大到小為：提取時間＞料液比＞提取溫度。

表3 回歸模型方差分析

2.3.2 交互作用分析 由圖5可知，因素A與因素B相互作用3D曲面彎折程度大，坡度較峭，且等高線為橢圓形，說明因素A與因素B之間的交互作用對小米多糖的提取率影響顯著。從3D圖可以看出，當因素A為2 h，因素B為80℃時小米多糖提取率最高，為3.051%。從等高線可以看出，因素B對小米多糖提取率的影響小于因素A，說明在因素A與因素B中，小米多糖提取率主要受因素A的影響。

圖5 提取時間和提取溫度對多糖提取率影響的響應面圖和等高線圖

由圖6可知，因素A與因素C相互作用3D曲面彎折程度小，坡度較緩，且等高線近似為圓形，說明因素A與因素C之間的交互作用對小米多糖的提取率影響不顯著。從3D圖可以看出，當因素A為2 h，因素C為20：1時小米多糖提取率最高，為3.042%。從等高線可以看出，因素C對小米多糖提取率的影響小于因素A，說明在因素A與因素C中，小米多糖提取率主要受因素A的影響。

圖6 提取時間和料液比對多糖提取率影響的響應面圖和等高線圖

由圖7可知，因素B與因素C相互作用3D曲面彎折程度小，坡度較緩，且等高線近似為圓形，說明因素B與因素C之間的交互作用對小米多糖的提取率影響不顯著。從3D圖可以看出，當因素B為80℃，因素C為20：1時小米多糖提取率最高，達2.969%。從等高線可以看出，因素B對小米多糖提取率的影響小于因素C，說明在因素B與因素C中，小米多糖提取率主要受因素C的影響。

圖7 提取溫度和料液比對多糖提取率影響的響應面圖和等高線圖

2.4 驗證試驗 運用響應面設計軟件對回歸方程進行計算，將提取時間、提取溫度、料液比的取值分別設定為1.5～2.5 h，75～85℃，15：1～25：1，并將目標值設定為最大值。獲得的最佳提取條件為：提取時間2.11 h，提取溫度80.6℃，料液比19.2：1。按此提取條件提取的小米多糖提取率為3.067%，根據實際操作情況將最優組合修改為提取時間2.1 h，溫度80℃，料液比19：1，在此條件下平行3次試驗。提取的小米多糖提取率為3.066%，與預測值接近，這說明回歸模擬準確可用，利用響應面結合主成分分析法優化小米多糖的提取的方法準確可行。

2.5 小米多糖的抑菌能力

2.5.1 小米多糖對供試細菌的抑菌測定 由表4可知，小米多糖對供試菌都具有抑制作用。且相對于陽性對照組，小米多糖的抑菌效果更強，其中小米多糖對革蘭氏陽性菌的抑菌效果最好，其抑菌直徑可達（12.75±1.76）mm。小米多糖對革蘭氏陰性菌的抑菌效果較弱，其抑菌圈直徑為 （10.03±1.53）mm，小米多糖對枯草芽孢桿菌的抑制效果最弱，其抑菌圈直徑為（8.77±0.79）mm。

表4 小米多糖對供試菌的抑菌效果 mm

2.5.2 小米多糖對供試菌的最低抑菌濃度 由表5可知，小米多糖提取液對三個供試菌的最小抑制濃度分別為1.1416、2.2832、4.5664 mg/mL， 小米多糖提取液對細菌的抑制作用隨濃度的增大而增強。

表5 小米多糖對供試菌的最低抑菌濃度

2.5.3 不同溫度下小米多糖對供試菌抑菌的測定從圖8可以看出，溫度的變化不會明顯影響小米多糖的抑菌效果，即使120℃下處理小米多糖后，其仍然具有抑菌能力。但隨著溫度的升高，小米多糖的抑菌效果會稍微降低，這是由于高溫破壞了小米多糖的結構。

圖8 不同溫度對供試菌抑菌的影響

2.5.4 不同pH下小米多糖對供試菌的測定 從圖9可以看出，不同酸堿度條件下的小米多糖的抑制作用有所不同，pH越趨于中性，小米多糖的抑菌效果越佳，在pH為7時，小米多糖對大腸桿菌的抑制效果最佳。而在酸性或堿性條件下，小米多糖的抑制能力都會受到影響，pH越低或越高，小米多糖的抑制能力越弱，這是由于強酸或強堿會破壞小米多糖的結構，活性降低，從而影響小米多糖的抑菌效果。

圖9 不同pH對供試菌的影響

3 結論

用熱水提法對沁州小米進行多糖提取，采用單因素試驗和響應面優化試驗相結合的方法，對小米多糖的提取條件進行優化得出：在提取時間2.1 h、提取溫度80℃、料液比19：1條件下，沁州小米多糖的平均提取率為3.066%。通過響應面模型分析可以得出，三個因素對小米多糖提取率的影響順序為：提取時間＞料液比＞提取溫度。對提取出的小米多糖進行抑菌作用研究表明，小米多糖對三種供試細菌都有一定的抑制作用，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別為1.1416、2.2832、4.5664 mg/mL。 對在不同溫度和pH條件下小米多糖對供試菌的抑菌研究得出，溫度的升高并不會明顯影響小米多糖的抑菌效果，強酸和強堿會降低小米多糖的抑菌效果，在中性條件下，小米多糖的抑制效果最佳。