蜜蜂遺傳育種新技術（二）
——分子遺傳標記

薛運波│文

分子標記技術以其共顯性、多態性和準確性等優點已廣泛應用于動植物的遺傳學研究，常用的分子標記包括以分子雜交為基礎的RFLP標記和ISH標記，以簡單重復序列為基礎的SSR標記、ISSR標記，以PCR為基礎的RAPD標記、AFLP標記和InDel標記，以單核苷酸多態性為基礎的SNP標記等。這里簡單介紹幾種常用的分子標記技術：

1.RFLP標記

限制性片段長度多態性（RFLP）是發展最早的分子標記技術。RFLP技術的原理是檢測DNA在限制性內切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，凡是可以引起酶切位點變異的突變如點突變和一段DNA的重新組織等均可導致RFLP的產生。此技術及其從中發展起來的一些變型均包括以下基本步驟：DNA的提取、限制性內切酶酶切、凝膠電泳分離、DNA片段轉移、特定DNA片段顯影和結果分析。

2.AFLP標記

擴增片段長度多態性（AFLP）標記技術較其他分子標記有著明顯的優越性，應用廣泛。其原理是基因組DNA經限制性內切酶充分酶切后，將特定的人工雙鏈接頭連在這些片段的兩端，形成帶接頭的特異片段，根據接頭序列和酶切位點設計引物，對特異性模板片段進行選擇性擴增，擴增產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，最后根據凝膠上DNA指紋的特點進行分析。AFLP標記技術的出現，是DNA指紋技術的重大突破，具有多重優點：（1）AFLP分析所需DNA用量少；（2）AFLP技術能夠獲得更高的信息量；（3）試驗重復性好，可信度高；（4）樣品適用性廣，基因組覆蓋面大；（5）AFLP標記表現為典型的孟德爾方式遺傳；（6）AFLP可作為物理圖譜和遺傳圖譜的聯系橋梁；（7）AFLP分析，不需要預先知道擴增基因組的序列特征等信息。

AFLP標記技術最初用于植物的遺傳育種、種質資源鑒定等，現已被大量用于動植物和微生物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構建、醫療診斷、系統發育和分類等研究領域。隨著蜜蜂分子生物學研究的不斷深入和蜜蜂基因組全序列的測定完成，AFLP分子標記技術也在蜜蜂學研究中初步應用，主要在以下幾個方面：（1）種質鑒定和遺傳多樣性分析；（2）遺傳圖譜構建；（3）基因定位；（4）標記輔助選擇育種；（5）蜜蜂疾病檢測等。

3.SSR標記

簡單重復序列（SSR）也叫微衛星序列，是由加拿大蒙特利爾大學的Zietkiewicz等建立的一種以簡單重復序列為基礎的分子標記。基于SSR的分子標記技術具有其自身獨特的優點：（1）SSR在生物的基因組中普遍存在，能夠對多種基因所表現出的多態性進行分析；（2）多種等位形式一般可共存于一個微衛星位點；（3）SSR標記是共顯性的，便于對隱形基因的選擇；（4）微衛星標記技術操作簡單，重復性好，結果可靠，在DNA量較少的情況下也能完成檢測。SSR標記技術的缺點是試驗流程復雜，消耗時間。

4.ISSR標記

微衛星（SSR）在真核基因組中無處不在，SSR標記的開發存在一個主要的瓶頸，即側鏈序列5′端錨定引物必須是已知的。1994年，Zietkiewicz等基于SSR又開發簡單序列間重復序列（ISSR）。ISSR分子標記具有簡單，快速，可靠并具有更高水平的DNA多態性的優勢，被用作遺傳研究的新分子標記（圖1）。ISSR分子標記是基于SSR，利用SSR自身來設計引物。ISSR分子標記技術無需序列知識，是以重復序列為基礎的引物。在PCR反應中，在SSR的3′端或5′端錨定1～4個核苷酸，使特定位點發生退火反應并對反向排列SSR間的DNA片段進行PCR擴增，之后進行電泳、染色，從而分析不同樣品間ISSR標記的多態性。與其他分子標記相比較，ISSR標記具有操作簡單、安全性高、成本低、模板DNA的用量少、無需測序和引物設計、多態性豐富、易操作、穩定性強、快捷方便以及適用廣泛等諸多優勢。ISSR分子標記的不足之處是PCR擴增時的最佳反應條件的摸索過程比較艱難，另外，ISSR分子標記呈孟德爾式遺傳（顯性遺傳標記），并且只是部分共顯性，因此不能有效區別檢測位點的顯性純合基因型和雜合基因型。

圖1 用于ISSR分子標記的熒光定量PCR設備

5.SNP標記

單核苷酸多態性（SNP）是指生物基因組上某個位點存在單個堿基的變化，包括單個堿基對的插入、缺失、轉換、顛換等。SNP作為基因組中最廣泛、分布頻率最高的遺傳標記，具有密度高、遺傳穩定性高和易于自動化分析等特點。SNP標記檢測技術的發展不斷地推陳出新，包括以單鏈構象多態性（SSCP）、酶切擴增多態性序列（CAPS）等基于凝膠電泳技術的傳統檢測方法，以焦磷酸測序（pyrosequencing）、微測序（SNaPshot）等的直接測序法，以及高分辨率熔解曲線分析技術（HRM）等新興檢測技術。隨著新一代DNA測序技術的發展（圖2），用于檢測SNP的DNA芯片技術也迅速興起，DNA芯片技術容易實現SNP高通量、自動化檢測，已經發展成為非常理想的SNP檢測技術。以SNP為基礎的分子標記技術被認為是繼RFLP、RAPD、SSR之后的新一代分子標記技術，因為其可以檢測出基因組DNA上每個堿基對的變化，對生命科學領域起到重要作用，特別是在動物遺傳育種領域的作用也日益凸顯，應用前景十分廣闊。

圖2 第三代基因測序設備