黨參根際土壤浸提液對其種子萌發和幼苗生長的影響

林 超， 邱黛玉， 陳 垣， 沈鵬瑞， 胡芳弟

(1.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070； 3.甘肅省中藥材規范化生產技術創新重點實驗室，甘肅 蘭州 730070； 4.西安利君制藥有限責任公司，陜西 西安 710000； 5.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730070)

黨參為桔梗科多年生草本植物黨參[Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.]、素花黨參[CodonopsispilosulaNannf.var.modesta (Nannf.)L.T.Shen]或川黨參(CodonopsistangshenOliv.)的干燥根[1]。因其具有補氣、養血的功效，也被稱為“小人參”。近年來，隨著市場需求的增加，在黨參產區連作現象較為嚴重，而連作容易破壞土壤中的生物和化學循環的平衡，從而使土壤養分和酸堿度發生變化，進一步造成作物產量和品質的惡化[2-4]。有研究者發現三七連作土壤會顯著降低三七種子發芽率，隨著連作年限的增加三七幼苗各生長指標逐漸下降,化感作用是導致三七連作障礙的主要原因[5]。當歸根際土壤水浸液也會嚴重抑制其種子萌發和幼苗生長[6]。

黨參在長期連作狀態下容易造成種內競爭激烈，自毒物質在土壤中過度積累，尤其是在植物根際容易形成高濃度的微環境，土壤理化性質、微生態系統受到嚴重干擾，導致土壤中有害病原菌增多，植物生長發育不良[7-9]。黃芪、當歸、半夏等藥用植物的栽培實踐中病害嚴重，產量和質量下降，很大程度上影響了中藥材產業的可持續性發展[10-12]。目前在黨參化感作用的研究中，對于化感物質的鑒別較少。為此，本試驗通過室內生物測量法研究黨參根際土壤水浸液對自身生長變化和幼苗抗氧化酶系統的影響，通過氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)測定篩選出疑似黨參化感自毒物質，為研究旱作農業區連作黨參化感自毒機理提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黨參種子采購于當地藥材市場，經甘肅農業大學農學院教授陳垣鑒定為黨參(Codonopsispilosula)。試驗用土壤為甘肅省隴南市宕昌地區重茬地的黨參根際土壤，pH 8.16，速效鉀 169.86 mg/kg，速效磷25.56 g/kg，硝態氮30.18 mg/kg，銨態氮18.01 mg/kg，有機質12.47 g/kg。取樣時間為生長初期(5月30日)、繁殖期(7月29日)、收獲期(9月28日)，采用五點法取樣，取3個生長時期黨參根際土壤，室溫下陰干，過4號篩。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理 采用雙因素隨機區組試驗設計，根際土壤取樣時間分別為：黨參生長初期、繁殖期和收獲期。精密稱取經陰干過篩的黨參各生長時期根際土100 g，加入到500 ml無菌去離子水中，振蕩并浸泡48 h后于臺式離心機上以3 600 r/min離心15 min。將上清液進行過濾，得到黨參根際土壤浸提液母液(X1)，留存備用。將X1稀釋2倍得到黨參根際土壤浸提液X2,稀釋4倍得到根際土壤浸提液X3，設置蒸餾水處理為空白對照(CK)。

1.2.2 種子發芽試驗 采用培養皿濾紙法，設置蒸餾水培養為空白對照(CK)，不同濃度根際土壤浸提液處理為處理組，共計10個處理，各3次重復，共30個培養皿。種子用15% NaClO3溶液浸泡消毒15 min，清水沖洗后放置于培養皿中，每皿各50粒。培養皿直徑為90 cm，底部放置2層濾紙，然后加入各處理浸提液5 ml。光照培養箱的光照周期為12 h光照/12 h黑暗，光照度為4 000 μmol/(m2·s)，溫度為25 ℃。定期補充相應濃度浸提液，維持濾紙濕潤即可。

1.2.3 幼苗生長試驗 采用小杯法測定，將生長7 d的幼苗移至組培瓶中繼續生長，并加入相應濃度的浸提液5 ml，繼續放回上述培養箱中培養。第20 d，測定黨參幼苗的莖長、根長和總鮮質量以及幼苗生理指標。采用Williamson等[13]的方法計算化感效應敏感指數(RI)，公式為：

C為空白對照指標的均值，T為處理組的均值。RI>0為化感促進作用，RI<0為化感抑制作用，|RI|可用于判斷化感作用強度。

自毒綜合效應(SE)：該值為種子發芽率、發芽勢及幼苗根長、莖長、鮮重等各測定指標RI的平均值，SE>0為化感促進，SE<0為化感抑制，絕對值的大小表示化感作用強弱。

1.3 測定指標

發芽率=發芽種子數(第7 d)/供試種子數×100%；發芽勢=發芽種子數(第5 d)/供試種子數×100%；莖長：從地上部分與地下部分的分界線開始，量至莖尖；根長：從地上部分與地下部分的分界線開始，量至根部最底端；鮮質量：每個處理3個培養皿中幼苗總鮮質量。

采用氮藍四唑(NBT)光化學還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用愈創木酚法測定過氧化物酶(POD)活性，采用雙組分分光光度法測定丙二醛(MDA)含量[14]。

1.4 自毒物質檢測

自毒物質檢測儀器為氣相色譜三重四級桿串聯質譜聯用儀(Agilent 7000D)，毛細管柱為HP-5MS(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)。質譜條件：電子轟擊(EI)源，轟擊電壓70 eV，掃描范圍 m/z 35～600 amu，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，載氣為He，流量為1 ml/min。測試條件：進樣口溫度250 ℃，初始柱溫50 ℃。以5 ℃/min程序升溫至210 ℃，保持2 min。

對照NIST質譜數據庫計算機檢索系統分析質譜圖，進行未知物的鑒定。采用峰面積歸一法計算各成分相對含量。

1.5 數據處理

試驗數據通過Excel 2019軟件進行作圖，SPSS 25.0進行方差分析(ANOVA)和顯著性差異分析(Duncan’s法，α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 黨參生長對其根際土壤浸提液的響應動態

自毒綜合效應指數(SE)反映化感自毒作用的強弱。從表1中可以看出，同一處理中黨參生長表現出明顯的濃度梯度效應，即隨著浸提液濃度逐漸升高，其對黨參種子萌發和幼苗生長的抑制作用增強，浸提液母液抑制作用最強。在同一質量濃度(浸提液母液)條件下，繁殖期∣SE∣>收獲期∣SE∣>生長初期∣SE∣，表明黨參幼苗生長在繁殖期根際土壤浸提液的處理下表現出較強的敏感性，對黨參生長初期根際土壤浸提液敏感性較弱；黨參莖長∣RI∣>根長∣RI∣，說明黨參根際土壤浸提液對自身抑制作用主要體現在幼苗生長方面。綜上所述，黨參3個生長發育時期中，繁殖期根際土壤水浸液對其種子發芽和幼苗生理生長表現出較強的抑制作用，該作用與水浸液濃度呈同向增長。

表1 黨參不同生長時期根際土壤浸提液對自身的自毒效應

2.2 根際土壤浸提液對黨參幼苗抗氧化酶活性和MDA含量的影響

由圖1可知，在黨參自毒物質脅迫下，黨參葉片SOD活性升高，而隨著自毒物質的不斷積累超出了植物自身調節范圍，造成活性氧在植物體內過量積累，SOD活性降低，黨參葉片在自毒效應下的抗氧化能力減弱。黨參根際土壤浸提液對黨參幼苗葉片SOD活性的化感效應存在濃度梯度差異，黨參生長初期的根際土壤浸提液抑制作用表現為X1處理>X2處理>X3處理，繁殖期的根際土壤浸提液和收獲期的根際土壤浸提液與生長初期的根際土壤浸提液表現相同；在同一濃度下各時期黨參根際土壤浸提液對黨參幼苗的抑制作用表現為繁殖期根際土壤浸提液>收獲期根際土壤浸提液>生長初期根際土壤浸提液。分析發現添加不同時期黨參根際土壤浸提液后黨參幼苗葉片SOD活性變化呈現一定規律，繁殖期X1濃度根際土壤浸提液處理的黨參幼苗SOD活性最低，說明對黨參幼苗的損害作用最大，較對照降低了27.51%；生長初期X3濃度根際土壤浸提液處理的SOD活性最高，較對照升高了15.15%。

X1、X2、X3見表1注，CK為蒸餾水空白對照。同一生長時期根際土壤浸提液不同小寫字母表示不同濃度處理間差異顯著(P<0.05)。圖1 黨參不同生長時期根際土壤浸提液對黨參幼苗SOD活性的影響Fig.1 Effects of rhizosphere soil extracts of C. pilosula at different growth stages on superoxide dismutase (SOD) activity of C. pilosula seedlings

黨參幼苗POD活性對黨參各生長時期根際土壤浸提液表現出不同的響應(圖2)。與對照相比，在X3處理下黨參不同生長時期根際土壤浸提液均能提高其幼苗POD活性，生長初期根際土壤浸提液X3處理下黨參幼苗POD活性達到最高，為7.25 U/(min·g)；而在X1、X2濃度下黨參不同生長時期根際土壤浸提液使黨參幼苗體內POD活性降低，繁殖期根際土壤浸提液X1處理下黨參幼苗POD活性降至最低，為3.85 U/(min·g)，說明在高濃度條件下黨參幼苗的保護細胞受損，在黨參自毒效應下的調節作用減弱。在同一濃度下黨參不同生長時期根際土壤浸提液對其幼苗毒害作用表現為繁殖期根際土壤浸提液>收獲期根際土壤浸提液>生長初期根際土壤浸提液，因此在黨參生長初期產生的自毒脅迫較其他生長時期弱。

X1、X2、X3見表1注，CK為蒸餾水空白對照。同一生長時期根際土壤浸提液不同小寫字母表示不同濃度處理間差異顯著(P<0.05)。圖2 黨參不同生長時期根際土壤浸提液對黨參幼苗POD活性的影響Fig.2 Effects of rhizosphere soil extracts of C. pilosula at different growth stages on peroxidase (POD) activity of C. pilosula seedlings

由圖3可知，化感自毒物質能顯著提高植物體內MDA含量，造成其活性氧過度積累，對植物產生毒害作用，不同生長時期黨參根際土壤浸提液不同濃度處理的黨參幼苗MDA含量變化表現一致。與對照相比，黨參繁殖期根際土壤浸提液X1處理下，黨參幼苗MDA含量高達1.104 6 μmol/g，說明高濃度黨參根際土壤浸提液對植物的毒害作用較大。黨參生長初期根際土壤浸提液處理下，與CK相對，X1、X2、X3處理MDA含量分別增長了67.60%、41.59%、26.09%；繁殖期根際土壤浸提液處理下，MDA含量分別增長了132.93%、108.28%、101.60%；收獲期根際土壤浸提液處理下，MDA含量分別增長了71.59%、44.50%、6.79%。黨參不同生長時期根際土壤浸提液X1、X2、X3處理下MDA含量均較對照高，說明黨參葉片細胞膜受傷害程度隨著浸提液濃度的增大不斷增加。整體而言，黨參不同生長時期根際土壤浸提液的自毒效應對黨參葉片MDA含量的增大程度表現為繁殖期根際土壤浸提液>收獲期根際土壤浸提液>生長初期根際土壤浸提液，表明黨參繁殖期自毒物質分泌旺盛，對其自身的毒害作用較強。

X1、X2、X3見表1注，CK為蒸餾水空白對照。同一生長時期根際土壤浸提液不同小寫字母表示不同濃度處理間差異顯著(P<0.05)。圖3 黨參不同生長時期根際土壤浸提液對黨參幼苗MDA含量的影響Fig.3 Effects of rhizosphere soil extracts of C. pilosula at different growth stages on malondialdehyde (MDA) content of C. pilosula seedlings

2.3 黨參根際土壤中的自毒物質

GC-MS分析結果(圖4、表2)顯示，黨參根際土壤浸提液中共發現異戊醛、甲酸、冰醋酸等13種物質，可能為黨參化感自毒物質，其中相對含量較高的是5-羥甲基糠醛和冰醋酸，分別占全部組分的43.64%和24.12%，硝酸異山梨酯和糠醇所占比例最少，為0.54%。

圖4 黨參根際土壤浸提液的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion flow chromatogram of water extract from rhizosphere soil of C. pilosula

表2 黨參根際土壤浸提液的化學組分

3 討 論

3.1 不同濃度黨參根際土壤浸提液對黨參的化感作用

植物經生物途徑向根際環境釋放化學信號，又由根系吸收貯存于植物體內，從而促進或抑制自身和種內植物的生長發育[15-16]。蘇一諾等[17]用不同濃度的苜蓿器官和根際土壤浸提液處理苜蓿種子，其種子萌發和幼苗生長明顯受抑，且抑制作用與濃度變化存在密切聯系，根際土壤浸提液的抑制效應顯著。霍鴻浩等[18]研究黃花蒿根、莖、葉不同濃度浸提液對小白菜和蘿卜種子萌發的影響，認為其對兩種蔬菜種子萌發均產生抑制作用，隨著濃度的增加，抑制作用增強。在蘭州百合、當歸、核桃和多花黃精等作物的化感作用研究中也表現出類似的效應[19-22]。本試驗通過研究黨參不同生長時期、不同濃度根際土壤浸提液處理黨參種子和幼苗，發現同一處理中黨參幼苗生長抑制表現出明顯的濃度梯度效應，隨著浸提液濃度的增加，不同生長時期根際土壤浸提液對黨參種子萌發和幼苗生長表現出持續抑制的現象。造成黨參種子萌發受抑的原因可能為不同濃度根際土壤浸提液中化感物質影響植物細胞的分裂和分化，進而影響了種子發芽和幼苗生長，使植物根系吸水、吸肥能力降低，長勢變弱。

3.2 根際土壤浸提液對黨參相關酶活性的影響

SOD和POD可清除植物細胞中多余的活性氧[23-27]。長期處于活性氧脅迫下，膜功能及結構容易受損，抗氧化酶活性受到抑制[28]。不同濃度半夏浸提液對3種農作物玉米、蘿卜和白菜SOD、POD活性的影響表現為低濃度促進，高濃度抑制，MDA含量與浸提液濃度呈正相關[29]。本研究結果表明，隨著浸提液濃度變化，黨參幼苗SOD和POD活性變化一致，在稀釋4倍濃度下與對照未達到顯著差異水平，濃度增大到稀釋2倍和母液時與對照差異顯著，與上述研究結論一致。原因可能是在外界低濃度自毒脅迫下，為應對短期內活性氧含量的迅速增加，黨參抗氧化酶活性隨之升高，以維持黨參的正常生理代謝，而在高濃度自毒環境脅迫下，活性氧的代謝超過了黨參的最大承受范圍，抗氧化酶活性反而降低；MDA含量增加顯示細胞膜結構和生理功能受到破壞，使得細胞內容物滲出、根系活力降低，最終抑制了黨參幼苗的生長。

3.3 黨參根際土壤中潛在化感物質

植物可以通過釋放化感物質對周圍植物產生毒害作用。有研究者發現，化感物質的種類和作物種類、釋放途徑存在密切關系，酚酸類和酯類物質是自毒物質的主要來源[30-31]。三七根系分泌物中酚酸類物質會積累在土壤中，對三七生長產生影響[32]。鄰苯二甲酸和對羥基苯甲酸抑制玉米根長、芽長、根鮮質量[33]。胡頹子根系分泌物中共鑒定出33種物質，分為酸、酯、烴等7大類，這些組分中有21種化合物已經被證實是具有化感作用的物質[34]。本試驗共檢測出7類13種化學物質，主要以醛類、酸類為主，其中5-羥甲基糠醛和冰醋酸的相對含量最高，硝酸異山梨酯和糠醇相對含量最低。檢測出的物質中冰醋酸為已知的酚酸類化感自毒物質，對植物種子萌發、植株生長、土壤酶活性和基本理化性質產生影響[35]。在后續的研究中對5-羥甲基糠醛和冰醋酸單體化合物進行了生物檢測，測試其化感效應，結果顯示兩種物質均對黨參植株生長產生抑制作用，說明5-羥甲基糠醛和冰醋酸可能為黨參的化感自毒物質。

4 結 論

黨參根際土壤浸提液明顯抑制自身種子發芽率、發芽勢，減慢幼苗根長、莖長和鮮質量的增長。抗氧化酶SOD、POD對不同濃度根際土壤浸提液的響應為先升高而后隨著浸提液濃度增大逐漸降低，任一濃度下MDA含量均升高。使用GC-MS對根際土浸提液進行鑒定，發現5-羥甲基糠醛和冰醋酸可能為黨參的化感自毒物質。