Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化脈絡(luò)舒通丸醇沉工藝△

石少瑜，竇希波a，楊碩，田文超，金鳳，劉向東*，杜昊忱*

1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006

脈絡(luò)舒通丸來(lái)源于國(guó)醫(yī)大師唐祖宣的臨床經(jīng)驗(yàn)方[1]，由黃芪、金銀花、黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、玄參、當(dāng)歸、白芍、甘草、水蛭、蜈蚣、全蝎12 味中藥組成，具有清熱解毒、化瘀通絡(luò)、祛濕消腫之功效，臨床上常用于濕熱瘀阻脈絡(luò)所致的血栓性淺靜脈炎[2]、精索靜脈曲張[3]，療效顯著。脈絡(luò)舒通丸制備工藝為水提醇沉，該過(guò)程中對(duì)蒸餾后的水溶液、水煎液的濃縮液（以下簡(jiǎn)稱濃縮液）進(jìn)行醇沉純化。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken 響應(yīng)面法，以綠原酸轉(zhuǎn)移率、黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率、干膏得率為指標(biāo)，考察濃縮液相對(duì)密度、濃縮液溫度、醇沉?xí)r間、攪拌速度、加醇體積流量對(duì)工藝的影響，并對(duì)關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000 RSLCnano 型液相色譜系統(tǒng)（607230 型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；e3695 型高效液相型色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）；R2002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申順生物科技有限公司）；KQ-250DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS105DU 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；Milli-Q 型超純水儀（法國(guó)Merck公司）；JJ-1型增力電動(dòng)攪拌器（江蘇瑞爾電器有限公司）；BT600-2J 型蠕動(dòng)泵（保定蘭格恒流泵有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品綠原酸（批號(hào)：110753-201817，純度：96.8%）、黃芪甲苷（批號(hào)：110781-201717，純度：96.9%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；磷酸（批號(hào)：201210681F）、氨水（批號(hào)：200902203K）、甲醇（批號(hào)：210422604H）、正丁醇（批號(hào)：200623172E）均為分析純，購(gòu)自南京化學(xué)試劑股份有限公司；乙腈為色譜純。

飲片黃芪（片，批號(hào)：450221026，安徽人民中藥飲片有限公司）；金銀花（凈，批號(hào)：453021018，山東中平藥業(yè)有限公司）；黃柏（絲，批號(hào)：455121008）、蒼術(shù)（段，批號(hào)：454921004）均購(gòu)自河北一達(dá)藥業(yè)有限公司；薏苡仁（凈，批號(hào)：455221008，臨沂柯屹藥業(yè)有限公司）；玄參（塊，批號(hào)：454821011，山西國(guó)新晉藥集團(tuán)道地藥材經(jīng)營(yíng)有限公司）；當(dāng)歸（段，批號(hào)：451121019）、甘草（段，批號(hào)：455321005）均購(gòu)自隴西縣康達(dá)藥業(yè)有限責(zé)任公司）；白芍（段，批號(hào)：455021005，臨沂市天一醫(yī)藥有限公司）；水蛭（段，批號(hào)：54720014）、蜈蚣（段，批號(hào)：54620010）、全蝎（粉，批號(hào)：54520012）皆購(gòu)自于哈爾濱福順堂藥材有限公司。樣品經(jīng)中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室范建偉高級(jí)工程師鑒定，全部符合《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020年版（一部）中相關(guān)規(guī)定[4]。

2 方法與結(jié)果

2.1 醇沉上清液制備

醇沉上清液制備按《中國(guó)藥典》2020 年版（一部）中脈絡(luò)舒通丸制法，金銀花833 g、蒼術(shù)417 g、玄參833 g、當(dāng)歸417 g、白芍417 g加水浸泡2 h，蒸餾提取7 h，收集揮發(fā)油。蒸餾后的藥渣與黃芪833.0 g、黃柏417.0 g、薏苡仁833.0 g、甘草138.0 g、水蛭208.5 g、蜈蚣16.5 g、全蝎69.0 g，加水煎煮2 次，每次1.5 h。合并煎液及蒸餾后的水溶液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.16～1.22，稱取相當(dāng)于原藥材150 g的濃縮液于燒杯中，在電動(dòng)攪拌下向濃縮液中勻速加入95%（20 ℃）乙醇至體積分?jǐn)?shù)為60%（20 ℃），密封，靜置，濾過(guò)，即得醇沉上清液。

2.2 定量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 黃芪甲苷色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（32∶68），等度洗脫；體積流量為1 mL·min-1；漂移管溫度為105 ℃；霧化器溫度為105 ℃；氣體流速為3.2 L·min-1；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為40 ℃。黃芪甲苷對(duì)照品及供試品的高效液相色譜（HPLC）圖見圖1。

綠原酸色譜條件：采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm；流動(dòng)相0.4%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～18 min，10%B；18～19 min，10%～90%B；19～25 min，90%B；25～26 min，90%～10%B；26～30 min，10%B）；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL，用外標(biāo)法定量。綠原酸對(duì)照品及供試品的HPLC圖見圖1。

圖1 脈絡(luò)舒通丸醇沉工藝對(duì)照品及供試品HPLC圖

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取綠原酸適量，置棕色量瓶中，精密稱定，加50%甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.164 mg·mL-1的溶液，0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

精密稱取黃芪甲苷適量，精密稱定，加純甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.346 7 mg·mL-1的溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 綠原酸供試品溶液制備：稱定相當(dāng)于脈絡(luò)舒通丸組方中0.21 g 金銀花原藥材的醇沉上清液，置于50 mL 量瓶中，加50%甲醇定容，稱定質(zhì)量，超聲溶解，放至室溫，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得[4]。

黃芪甲苷供試品溶液制備：稱定相當(dāng)于脈絡(luò)舒通丸組方中4.2 g黃芪原藥材的醇沉上清液，置于水浴鍋上蒸干。殘?jiān)訜崴?0 mL 使其溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加正丁醇80 mL，搖勻，加入氨試液40 mL，洗滌2 次，每次30 min。回收正丁醇液，殘?jiān)蛹状迹D(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得[4]。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取2.2.2 項(xiàng)下綠原酸對(duì)照品溶液1、2、4、6、8 mL 置于10 mL 量瓶中，以50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=29 529.0X-1 867.6（r=0.999 9），表明綠原酸在16.40～131.20 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。

分別精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液10、20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，以峰面積進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1.898X+0.935（r=1.000 0），表明黃芪甲苷在3.467～6.934 μg的對(duì)數(shù)值與峰面積的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：分別取綠原酸、黃芪甲苷同一對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，綠原酸、黃芪甲苷的峰面積RSD 分別為0.23%、0.74%，表明該方法精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取脈絡(luò)舒通丸醇沉上清液1 份，按2.2.3 項(xiàng)下方法制備6 份平行供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，綠原酸、黃芪甲苷含量的RSD 分別為1.23%、0.95%，表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取脈絡(luò)舒通丸醇沉上清液1 份，按2.2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、4、8、16、24、48 h，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，綠原酸、黃芪甲苷峰面積的RSD 分別為1.05%、1.31%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收率試驗(yàn)：取9 份已知含量的醇沉上清液1 mL，分別置于50 mL 量瓶中，分別加入綠原酸對(duì)照品溶液5、7、9 mL，定容。另取9 份已知含量的醇沉上清液3 mL，分別加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液4、6、8 mL，按2.2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，綠原酸、黃芪甲苷的平均回收率分別為98.93%、100.20%，RSD 分別為1.42%、0.99%，均小于3%，表明在該色譜條件下測(cè)定樣品中綠原酸、黃芪甲苷的準(zhǔn)確度符合要求。

2.3 有效成分轉(zhuǎn)移率測(cè)定

取濃縮液和醇沉上清液，按2.2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定綠原酸、黃芪甲苷的含量，按公式（1）計(jì)算各物質(zhì)的轉(zhuǎn)移率（T）。

式中m1為醇沉上清液中有效成分含量，m2為濃縮液中有效成分含量。

2.4 干膏得率測(cè)定

稱取醇沉上清液約10.00 g（m4），置于干燥至質(zhì)量恒定的蒸發(fā)皿（m3）中，水浴蒸干后于105 ℃常壓干燥箱中干燥至質(zhì)量恒定，取出置于干燥器中冷卻30 min，精密稱定干物質(zhì)和蒸發(fā)皿的質(zhì)量（m5），按公式（2）計(jì)算醇沉上清液的干膏得率（S）。

2.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

按照《中國(guó)藥典》2020 年版（一部）要求[4]，以綠原酸、黃芪甲苷T為指標(biāo)表征醇沉上清液中有效成分的T，以S為指標(biāo)表征醇沉除雜率，考察濃縮液相對(duì)密度、濃縮液溫度及醇沉?xí)r間對(duì)醇沉效果的影響。為減小因操作水平帶來(lái)的誤差，對(duì)加醇體積流量、攪拌速度進(jìn)行考察，為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的選擇提供依據(jù)。根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)水平設(shè)3個(gè)平行。

將各單因素結(jié)果根據(jù)公式（3）進(jìn)行Z-Score標(biāo)準(zhǔn)化處理[5]，S為負(fù)相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)（-z），將各水平數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理值進(jìn)行加和，得到綜合評(píng)分。

式中z為T，是正相關(guān)數(shù)據(jù)，為標(biāo)準(zhǔn)化后的變量值，x為原數(shù)據(jù)，xˉ為算術(shù)平均值，σ為標(biāo)準(zhǔn)差。

2.5.1 濃縮液相對(duì)密度 在濃縮液溫度60 ℃、加醇體積流量30 mL·min-1、攪拌速度中檔、醇沉?xí)r間24 h、醇沉靜置溫度7 ℃的條件下，分別考察濃縮液相對(duì)密度1.14、1.16、1.18、1.20、1.22。將醇沉上清液按2.2.1、2.2.3 項(xiàng)下方法測(cè)定綠原酸、黃芪甲苷T，按2.4 項(xiàng)下方法測(cè)定S。根據(jù)表1 結(jié)果，結(jié)合相對(duì)密度小耗醇量大、后續(xù)濃縮工作量大等實(shí)際情況，選擇濃縮液相對(duì)密度1.18～1.22 進(jìn)行響應(yīng)面工藝優(yōu)化。

2.5.2 醇沉?xí)r間 在濃縮液相對(duì)密度1.22、濃縮液溫度60 ℃、加醇體積流量30 mL·min-1、攪拌速度中檔、醇沉靜置溫度7 ℃的條件下，分別考察醇沉?xí)r間12、24、36、48、72 h。將醇沉上清液按2.2.1、2.2.3 項(xiàng)下方法測(cè)定綠原酸、黃芪甲苷的T，按2.4 項(xiàng)下方法測(cè)定S，并按綜合評(píng)分法進(jìn)行計(jì)算。根據(jù)表1 結(jié)果，結(jié)合操作周期過(guò)長(zhǎng)、耗費(fèi)成本大等實(shí)際情況，選擇醇沉?xí)r間12～36 h 進(jìn)行響應(yīng)面工藝優(yōu)化。

2.5.3 濃縮液溫度 在濃縮液相對(duì)密度1.22、加醇體積流量30 mL·min-1、攪拌速度中檔、醇沉?xí)r間24 h、醇沉靜置溫度7 ℃的條件下，分別考察濃縮液溫度40、50、60、70、80 ℃。將醇沉上清液按2.2.1、2.2.3 項(xiàng)下方法測(cè)定綠原酸、黃芪甲苷T，按2.4 項(xiàng)下方法測(cè)定S。根據(jù)表1 結(jié)果，選擇濃縮液溫度50～70 ℃進(jìn)行響應(yīng)面工藝優(yōu)化。

2.5.4 加醇體積流量 在濃縮液相對(duì)密度1.22、濃縮液溫度60 ℃、攪拌速度中檔、醇沉?xí)r間24 h、醇沉靜置溫度7 ℃的條件下，分別考察加醇體積流量10、20、30、40、50、60 mL·min-1。將醇沉上清液按2.2.1、2.2.3 項(xiàng)下方法測(cè)定綠原酸、黃芪甲苷T，按2.4 項(xiàng)下方法測(cè)定S。根據(jù)表1 結(jié)果，加醇體積流量為30 mL·min-1時(shí)綜合評(píng)分最高。

2.5.5 攪拌速度 在濃縮液相對(duì)密度1.22、濃縮液溫度60 ℃、加醇體積流量30 mL·min-1、醇沉?xí)r間24 h、醇沉靜置溫度7 ℃的條件下，分別考察攪拌速度低、中、高3 檔。將醇沉上清液按照按2.2.1、2.2.3 項(xiàng)下方法測(cè)定綠原酸、黃芪甲苷的T，按2.4項(xiàng)下方法測(cè)定S。根據(jù)表1結(jié)果，攪拌速度為中檔時(shí)綜合評(píng)分最高。

醇沉的目的是除去雜質(zhì)，最大程度地保留藥物中有效成分。因此，醇沉過(guò)程的操作工藝及其設(shè)備適用性與中藥產(chǎn)品的穩(wěn)定性和有效性密切相關(guān)，與產(chǎn)品的劑型和質(zhì)量是不可分割的有機(jī)整體。由于本研究中的設(shè)備不具有通用性，本著減少操作誤差的初衷對(duì)加醇體積流量及攪拌速度進(jìn)行考察，因此兩者不作為因變量納入后續(xù)的響應(yīng)面工藝優(yōu)化。

根據(jù)表1結(jié)果，選擇加醇體積流量30 mL·min-1、攪拌速度中檔，在此條件下醇沉過(guò)程中濃縮液不會(huì)出現(xiàn)局部乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高造成有效成分被沉淀物包裹的現(xiàn)象[6]，有利于除去雜質(zhì)，減少有效成分的損失。

表1 脈絡(luò)舒通丸醇沉工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

在上述分析基礎(chǔ)上，確定濃縮液相對(duì)密度1.18～1.22、醇沉?xí)r間12～36 h、濃縮液溫度50～70 ℃進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面工藝優(yōu)化。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)原理，以濃縮液相對(duì)密度（A）、醇沉?xí)r間（B）、濃縮液溫度（C）為因變量，黃芪甲苷T、綠原酸T、S為自變量，設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及考察水平見表2，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 脈絡(luò)舒通丸醇沉工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

應(yīng)用Design Expert 12.0.3.0軟件對(duì)表3中綜合評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到二次多元回歸模型方程：Y=1.95-0.62A-0.22B+0.22C+0.22AB-0.01AC+0.65BC-2.73A2-0.54B2-0.86C2（r=0.983 1）。r接近1，表明通過(guò)二次回歸得到綜合評(píng)分模型與試驗(yàn)擬合較好，能較準(zhǔn)確反映3個(gè)因素對(duì)脈絡(luò)舒通丸醇沉工藝的影響。方差分析結(jié)果（表4）表明，該回歸整體模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此該模型成立。A、BC、A2、B2和C2項(xiàng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。由F值大小可以推斷，在所選擇的試驗(yàn)范圍內(nèi)3個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響A＞B＞C，因素B與C的交互作用為主要交互作用，與響應(yīng)面曲線坡度陡峭程度也相吻合（圖2）。根據(jù)響應(yīng)面圖分析得最佳工藝條件：濃縮液相對(duì)密度為1.20，醇沉?xí)r間為23.47 h，濃縮液溫度為61.10 ℃，綜合評(píng)分為1.84。

圖2 脈絡(luò)舒通丸醇沉工藝中各因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面圖

表3 脈絡(luò)舒通丸醇沉工藝響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表4 脈絡(luò)舒通丸醇沉工藝響應(yīng)面二次回歸方程方差分析

2.7 醇沉工藝優(yōu)化結(jié)果和驗(yàn)證

為檢驗(yàn)預(yù)測(cè)的結(jié)果，需對(duì)預(yù)測(cè)的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證。參照2.6 項(xiàng)下最優(yōu)醇沉工藝，結(jié)合試驗(yàn)生產(chǎn)條件的可操作性，將驗(yàn)證條件調(diào)整為濃縮液相對(duì)密度1.20，醇沉?xí)r間24 h，濃縮液溫度60 ℃。按此工藝條件進(jìn)行脈絡(luò)舒通丸濃縮液醇沉，平行操作3 次，結(jié)果見表5。對(duì)結(jié)果的均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得綜合評(píng)分為1.93，與預(yù)測(cè)值1.84 相比相對(duì)誤差為4.5%（＜5%）。

表5 脈絡(luò)舒通丸醇沉工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

中藥醇沉的生產(chǎn)環(huán)境溫度受季節(jié)影響大，季節(jié)性的濃縮液溫度和醇沉靜置溫度差異是影響醇沉效果的關(guān)鍵因素之一，為控制醇沉過(guò)程中藥產(chǎn)品的質(zhì)量，在確保有效成分含量達(dá)標(biāo)的情況下，統(tǒng)一醇沉溫度對(duì)確保中藥產(chǎn)品質(zhì)量、減少批次差異至關(guān)重要。因此，本研究采用中藥大生產(chǎn)過(guò)程中普遍采用的7 ℃作為醇沉溫度，以確保優(yōu)化的參數(shù)準(zhǔn)確、可靠。

本研究中所建立的數(shù)學(xué)模型擬合程度高、試驗(yàn)誤差小。在醇沉靜置溫度為7 ℃。醇沉終點(diǎn)乙醇體積分?jǐn)?shù)60%的條件下，最佳的醇沉純化工藝條件：濃縮液相對(duì)密度為1.20，醇沉?xí)r間為24 h，濃縮液溫度為60 ℃。在此醇沉條件下脈絡(luò)舒通丸中各主要有效物質(zhì)的T高、S適中、綜合評(píng)分與預(yù)測(cè)值相差較小，表明該數(shù)學(xué)模型具有指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)的意義。由響應(yīng)面法優(yōu)化得到的醇沉工藝參數(shù)準(zhǔn)確、可靠，可為脈絡(luò)舒通丸制劑生產(chǎn)的工藝優(yōu)化提供參考。