天麻新品系“略麻-1號”選育及質量評價△

王海峰，李曉東，付玉平，黃欽，李明，董林林，陳士林

1.中國中醫科學院 中藥研究所，北京 100700；2.大理大學 藥學院，云南 大理 671000；3.略陽縣中藥材技術推廣服務中心，陜西 漢中 724300

天麻Gastrodia elataBl.是異養蘭科植物，無根、無綠色葉片，須與蜜環菌伴生[1]。其以干燥塊莖入藥，具有極高的營養價值和顯著的藥理活性[2]。現代研究表明，天麻主要含有天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷、多糖、氨基酸等有效成分[3-4]，具有抗氧化[5]、抗抑郁[6-7]、抗衰老[8]、抗炎[9-11]、抗癲癇、抗驚厥[12-14]、鎮痛鎮靜[15-16]等藥理作用。2019 年11 月25日，國家衛生健康委員會、國家市場監督管理總局聯合下發了《關于對黨參等9 種物質開展按照傳統既是食品又是中藥材的物質管理試點工作的通知》，為天麻食品開發提供了政策依據。

隨著市場需求不斷增大，野生天麻被過度采挖，導致其野生種質資源日益匱乏，甚至瀕臨滅絕，人工栽培已成為天麻的主要來源[17]。在集中栽培、異地栽培等過程中，天麻種群變異和退化問題嚴重，導致產量和品質下降，嚴重制約天麻產業的可持續發展[18]。其栽培過程中易遭受雜菌感染或腐爛病等危害，導致表皮潰爛、生長受阻、產量降低和品質變劣[19]。因此，選育抗病強、繁殖力強、退化弱、高產優質的新品種是保障天麻產業健康可持續發展的重要舉措。

陜西省略陽縣是我國天麻傳統道地產區之一，全縣地存天麻10 000畝（1畝≈666.67 m2）500萬窩，年可產麻種2000 t，商品干天麻超過1000 t。2006年以來，“略陽天麻”先后通過國家食品藥品監督管理局《中藥材生產質量管理規范》（以下簡稱GAP）認證和國家地理標志保護產品認證，已成為當地的特色支柱產業，在脫貧攻堅和鄉村振興工作中發揮了重要作用。但是，該地區也面臨栽培品種退化和優質天麻新品種匱乏的問題，本課題組利用略陽縣豐富的天麻種質資源優勢，經過多年的系統選育，培育出紅天麻“略麻-1 號”（ZYXP-2020-006），并在陜西、湖北等地進行推廣。本研究以“略麻-1號”和安徽紅天麻為研究對象，通過對“略麻-1 號”性狀、產量、有效成分進行系統分析，為優質天麻生產提供數據參考。

1 材料

1.1 樣品

野生天麻（RYB-1）、蜜環菌（Am-23-4）、萌發菌（GSF-8104）均由陜西漢王略陽中藥科技有限公司提供。“略麻-1 號”和安徽紅天麻均為質量200～250 g、無病蟲害、體型完整、頂芽飽滿完整的箭麻。“略麻-1 號”、安徽紅天麻及RYB-1 經中國中醫科學院中藥研究所趙慶賀副研究員鑒定為紅天麻Gastrodia elataBI.f.elata。

1.2 儀器

ME203E/02 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；5425R 型離心機（德國Eppendorf）；B-220 型恒溫水浴鍋、RE-2000 型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ5200V 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DGG-9070B 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；FW200 型高速萬能粉碎機（北京科偉永興儀器有限公司）；Arc 高效液相色譜系統（美國Waters公司）。

1.3 試藥

對照品天麻素（批號：M11GB148059，純度＞98%）、對羥基苯甲醇（批號：R09D8X50333，純度≥98%）均購于上海源葉生物技術有限公司；D（+）-無水葡萄糖對照品（批號：1122A0231，純度≥98%）、牛血清白蛋白（BSA，批號：809A052，純度≥96%）、考馬斯亮藍G-250 溶液均購于北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、濃硫酸、85%磷酸均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；乙腈［色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；甲醇（色譜純，北京化工廠）；水為屈臣氏純凈水。

2 方法

2.1 選育過程

RYB-1 采挖于略陽縣白水江鎮的林地（E106°01′14″，N33°26′25″，海拔1 267.26 m），通過人工有性繁殖，對RYB-1 進行自交選育，獲得“略麻-1號”種莖（圖1）。選育過程中淘汰箭麻質量＜100 g、抽薹生育期＜50 d、每穗蒴果直徑＜30 cm 的天麻繁殖材料，將后代性狀不一致的材料按選育標準進行淘汰，將符合目標性狀的箭麻再進行自交，將2 代箭麻按目標進行選育，獲得3 代自交選育的穩定紅桿品種，將此品種進行田間試驗，觀察其性狀、生物學特性、病蟲害發生情況，并檢測產量、天麻素等藥用成分含量。選育過程中種植地均為砂壤，pH 為6.8，年均降雨量為850 mm，大田栽培，夏季遮陽，田間種植按中藥材GAP進行常規管理。

圖1 “略麻-1號”選育流程

2.2 品種測試

按中華人民共和國農業行業標準《植物品種特異性、一致性和穩定性測試指南天麻》（NY/T 2593—2014）[20]規定進行，測試周期為箭麻開始萌動，經過抽薹、開花到成熟的生長過程。在室內進行以筐栽人工授粉方式種植，溫度為20～25 ℃，相對濕度為60%～80%。選取與測試品種接近的品種作為對照品種，根據“略麻-1號”形態特性選擇近似品種安徽紅天麻作為對照。選育品種及對照組每個品種均種植60個。

2.3 田間試驗

以五龍洞鎮中川壩（N33°30′40.19″、E106°51′13.07″，海拔1000 m，土壤pH 6.7，砂壤土）為實驗點，進行天麻大田栽培試驗。3 月初室內育種，開展品種測試，5月大田栽培。大田栽培步驟：1）先做畦，畦寬約0.7 m，長度依據地形規劃，按上下2層共10根棒為1窩（約0.5 m2）標準（每窩天麻蒴果10 個，600 mL 蜜環菌和萌發菌瓶各1 瓶，櫟類青岡樹10根，直徑6 cm，長50 cm，有魚鱗口，大小比較均一）；2）拌種，將萌發菌與天麻種子輕輕攪拌均勻；3）播種，將拌好的含天麻種子的萌發菌葉均勻地撒在鋪滿濕樹葉的畦底，再將5 根樹棒均勻放上，間距4～6 cm，在樹棒兩側與魚鱗口處均勻擺放蜜環菌數節，覆蓋濕砂土，同樣方法種植第2 層，最后將砂土填成龜背狀，按照中藥材GAP 進行常規管理。選育品種與對照品種每20 m2小區作為1個重復，每個品種3 個重復。種植150 d 后，每個小區隨機選取3 窩觀察種莖生長狀況。17個月后隨機選取3窩統計折干率、有效成分含量及產量，將收集到的新鮮天麻樣品分別洗凈、烘干、趁鮮切薄片，放入電熱鼓風干燥箱（45 ℃）干燥，將烘干的樣品用高速萬能粉碎機打成粗粉（過三號篩）備用。

2.4 樣品檢測

2.4.1 樣品處理及折干率測定方法 按參考文獻[21]測定天麻折干率，將采挖鮮天麻洗凈，晾干表面水分，測定鮮質量，蒸至透心，放冷后置55 ℃電熱鼓風干燥箱烘至4～5成干，取出，回潮12 h，繼續干燥、回潮重復多次至恒重，按公式（1）計算折干率。

2.4.2 天麻素和對羥基苯甲醇含量測定 按《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版天麻項下高效液相色譜法測定天麻素和對羥基苯甲醇的總量[22]。

2.4.3 多糖含量測定 按參考文獻[23]苯酚-硫酸法測定天麻多糖含量，標準溶液制備及標準曲線繪制：精密稱取D（+）-無水葡萄糖對照品10 mg（105 ℃干燥至恒重），加入蒸餾水，制成0.1 mg·mL-1葡萄糖標準液。分別精密吸取葡萄糖標準液0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 mL于試管中，加蒸餾水至2.0 mL，加入5%苯酚1 mL，搖勻后加濃硫酸5 mL，搖勻，蒸餾水定容，于40 ℃水浴保溫10 min，冷卻至室溫后測定490 nm 處吸光度值，以標準液質量濃度（mg·mL-1）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

取天麻樣品粉末1.00 g，加入80%乙醇25 mL，60 ℃浸泡2 次，每次30 min，濾過，低溫烘干，加入去離子水200 mL，50 ℃超聲提取40 min，得天麻多糖提取液。將天麻多糖提取液2 mL 稀釋5 倍，吸取0.2 mL 于試管中加蒸餾水至2 mL，按標準曲線繪制方法，測定490 nm吸光度值。

2.4.4 蛋白質含量測定 按參考文獻[24]考馬斯亮藍染色法測定天麻蛋白質含量。標準溶液制備及標準曲線繪制：取BSA 100 μL 加入PBS 緩沖液2.4 mL中，稀釋至終質量濃度為0.2 mg·mL-1。準備6 支干凈試管，編號。分別吸取0、100、200、300、400、500μL BSA 標準溶液，依次添加磷酸鹽緩沖液（PBS）500、400、300、200、100、0 μL，加入1×G-250染色液5 mL，反應3 min后在波長595 nm處測定吸光度值，以標準液質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

供試品溶液制備及蛋白質含量測定：取天麻粉末2.00 g，加入去離子水100 mL，在沸水浴條件下提取2 次，每次126 min，濾過，合并濾液，即得天麻蛋白質溶液。精密量取適量稀釋的樣品溶液0.5 mL，加入1×G-250染色液5 mL反應3 min后在波長595 nm處測定吸光度值。

2.5 數據分析 采用SPSS 17.0 軟件對實驗數據進行處理，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 “略麻-1號”花莖及花的性狀

“略麻-1號”花莖顏色為橙紅色，花莖平均高度為125.10 cm，比安徽紅天麻高33.8%；花莖平均粗度為12.01 mm；花序軸長平均為41.73 cm，比安徽紅天麻高86.29%；花被筒平均長度為10.08 mm，寬度平均為6.57 mm，長寬比平均為1.53，花子房長度平均為9.79 mm。與對照品種安徽紅天麻相比，“略麻-1號”花莖高和花序軸較長（圖2～3）。

圖2 安徽紅天麻和“略麻-1號”花莖

圖3 安徽紅天麻和“略麻-1號”花莖及花的性狀（±s, n=60）

3.2 “略麻-1號”果實性狀

“略麻-1號”果實為紅褐色，長度平均為25.17 mm，寬度平均為7.21 mm，長寬比平均為3.49，其長度、寬度比安徽紅天麻分別高25.10%、2.70%；單個果實鮮質量平均為0.72 g，比安徽紅天麻高63.64%；每株果實數量平均為62 個，比安徽紅天麻多12.72%。與安徽紅天麻相比，“略麻-1號”果實長且寬，鮮質量大，單株數量多（圖4）。

圖4 安徽紅天麻和“略麻-1號”果實性狀（±s, n=60）

3.3 “略麻-1號”種莖及箭麻性狀

“略麻-1 號”種莖短粗成子彈狀，色澤黃白色，無蜜環菌纏繞；箭麻病蟲害少，呈扁平狀或長筒狀，平均長138.41 mm、寬60.93 mm，環紋清晰。安徽紅桿箭麻較細長，環紋較淺，平均長137.04 mm、寬47.50 mm（圖5～7）。

圖5 安徽紅天麻和“略麻-1號”的種莖

3.4 “略麻-1號”品質分析

“略麻-1號”折干率適中，為14.31%，其天麻素和對羥基苯甲醇質量分數之和為0.42%，比安徽紅天麻提高了35.48%。“略麻-1號”多糖、蛋白質質量分數分別為16.60%、6.07%，與安徽紅天麻差異無統計學意義。

圖6 安徽紅天麻和“略麻-1號”的箭麻

圖7 安徽紅天麻和“略麻-1號”的長度及寬度（±s, n=60）

3.5 “略麻-1號”產量分析

“略麻-1號”天麻總產量及白麻產量均顯著高于安徽紅天麻。“略麻-1號”平均單窩產量為2 495.50 g，安徽紅天麻平均單窩產量為1 235.55 g，總產量提高了101.97%。“略麻-1號”箭麻、白麻平均單窩產量分別為1 240.50、1 269.00 g，比安徽紅天麻提高了48.92%、180.96%。

4 討論

天麻種植方式一般為無性繁殖和有性繁殖，無性繁殖見效快，但長期無性繁殖易導致天麻種性退化、病害嚴重，產量及品質下降[25-26]；有性繁殖有效克服無性繁殖種性退化問題，同時為定向培育優質種麻提供有效途徑[27]。天麻選育過程中，利用有性繁殖技術并通過雜交或自交育種技術可培育無退化、產量高、品質好的天麻品種[28-29]。天麻蒴果數越多，單蒴果質量越大，種子數越多[27]，更有利于天麻種子培育和有性繁殖。隨著天麻大面積栽培，病蟲害問題日益嚴重，導致天麻品質變劣、產量降低甚至絕收[30-31]。因此，選育抗病性強的天麻新品種是防治病害、提高產量的有效途徑之一。高產高含量的天麻新品種也陸續選育成功，如高產新品種“鄂天麻1號”“鄂天麻2號”[32-33]。

本研究通過人工授粉有性繁殖，多代自交選育獲得優質新品系“略麻-1 號”，與安徽紅天麻相比，“略麻-1號”花莖高且粗，花序軸長（41.73 cm）且花序多；果實長且寬、鮮質量大（0.72 g）且數量多；種莖短粗呈子彈狀，色澤黃白色，無蜜環菌纏繞，無退化現象。“略麻-1號”病蟲害少且總產量提高101.97%，天麻素與對羥基苯甲醇總含量比《中國藥典》2020 年版標準規定的含量高了68%。結果表明，“略麻-1號”抗病強、產量高、藥用成分含量高、繁殖力強且種莖無退化現象，為天麻種植提供優質的種源。“略麻-1號”選育及推廣可為優質商品天麻提供重要種質資源，實現天麻增產增收，促進天麻產業可持續發展。