甘草粉末粒度分布與其品質的相關性研究△

李錟，王升，田壯，尚興樸，李鵬英，呂朝耕，康傳志，萬修福，周利，郭蘭萍，王瑞杉*

1.中國中醫科學院 中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；2.中國中藥有限公司，北京 102600

甘草始載于《神農本草經》，列為上品，為豆科多年生植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖，味甘，性平[1]，可補脾益氣、清熱解毒、潤肺止咳，能夠調和諸藥，故有“國老”之稱。甘草酸和甘草苷是甘草的主要活性成分，具有鎮咳、消炎、解毒、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、調血脂和抗動脈粥樣硬化等藥理作用[2-3]。另外，甘草具有較強的抗旱、抗寒、耐鹽堿和防風固沙能力[4]，還廣泛應用于食品、飲料和化妝品等行業[5-6]。隨著國內外市場對甘草資源需求量的增加，野生資源迅速枯竭，目前市場上甘草藥材多為人工種植，由于地理環境的差異、種植不規范導致其質量良莠不齊[7]。

傳統觀點認為甘草以粉性為佳[8-9]，《本草品匯精要》稱：“根堅實有而肥者為好”[10]。《本草從新》記載：“大而結者良，出大同，名粉草（彈之有粉出），細者名統草”[11]。甘草粉性通常量化為淀粉含量或顯微鏡下淀粉粒數目，認為淀粉含量越多則甘草品質越好。但關于甘草粉性與淀粉含量、淀粉粒特征的研究表明，甘草淀粉含量與有效成分含量往往呈負相關[12-13]。其中Liu 等[13]研究發現甘草的粉性與甘草酸、甘草苷的含量，直鏈淀粉與總淀粉的比例及粒徑超過5 μm 的淀粉粒數量呈正相關，與總淀粉含量呈負相關。以“粉性”等傳統性狀鑒別評價甘草品質受到了挑戰，亟需更為準確的方法詮釋甘草粉性的量化標準和科學內涵。

近年來，激光衍射已經成為普遍認可的粉體表征技術，在食品、醫藥、化工、農業等領域得到廣泛應用。激光衍射粒度分析儀具有測量速度快、測量過程自動化程度高、衍射譜僅與顆粒大小有關等優勢[14]，尤其重要的是激光衍射可以通過表征粒度分布鑒別不同樣品，并解釋樣品的獨特品質。例如，不同種類咖啡產品研磨后咖啡粉粒度分布情況明顯不同，精細咖啡粉在沖泡時可以產生獨特的苦味，而隨著咖啡粉粒徑的增加，產品的口感則逐漸順滑[15]。中藥材活性成分在不同組織中含量存在差異，會導致其粉體粒徑大小、形狀、表面特征等顆粒學性質不完全相同，如易碎組織在粉碎過程中易形成小顆粒，不易粉碎的組織則在大顆粒粉末中較多[16]。因此，可將激光衍射粒度分布檢測技術用于鑒別具有組織特性差異的藥材，也可將粒度分布與藥效成分含量進行關聯，以期來量化對藥材品質的評價。

本研究以甘草為材料，建立檢測甘草粉末粒度的方法。利用粉末粒度分布表征甘草粉體特征，同時以甘草酸和甘草苷類化合物的含量表征不同產地甘草的品質優劣，通過分析甘草粉末粒度分布與甘草有效成分含量之間的相關性，為快速、準確評價甘草品質特征提供理論指導，同時也為粒度分析儀在中藥領域的應用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

實驗樣品收集于新疆、內蒙古、甘肅3 個省（自治區）21 個產地（縣/市）藥材收購商/合作社，共40份，包括10個甲等、18個乙等、12個丙等，均為秋季采收，3年生樣品，經中國中醫科學院中藥資源中心王升副研究員鑒定為豆科植物烏拉爾甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。具體信息見表1。

表1 甘草樣品信息

對照品皂苷類化合物22-β-乙酰氧基-甘草酸（1，批號：J24GS147479）、甘草皂苷G2（2，批號：Z29J11H119881）、甘草酸（3，批號：Y30J11Q119843）和黃酮苷類化合物甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷（4，批號：G09J11Y111183）、芹糖甘草苷（5，批號：Z29J11H117017）、維采寧（6，批號：J24GS158679）、甘草苷（7，批號：Z29J11H107681）、黃甘草苷（8，批號：Y30J11Q617243）、芒柄花苷（9，批號：G09J11Y517183）、芹糖異甘草苷（10，批號：J24GS532509）、異甘草苷（11，批號：Y30J11Q117543）均購自云南西力生物技術股份有限公司，純度均大于95%；實驗用乙醇、甲醇、乙腈均為色譜純；水為實驗室自制超純水。

1.2 儀器

Mastersizer 2000 型激光衍射粒度分析儀（馬爾文帕納科公司）；ACQUITY UPLC H-CLASS 系統，ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），VanGuard預柱（5 mm×2.1 mm，1.8 μm）均購于美國Waters 公司；FW177 型中藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；ML104T/02型電子天平（梅特勒-托利多公司）；Pacific TⅡ型超純水系統（賽默飛世爾科技有限公司）；SB-800 DTD型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 樣品處理

甘草樣品干燥，稱取樣品約250 g，于中藥粉碎機粉碎2次、每次1 min，過二號篩[（850±29）μm]。

2.2 甘草粉末粒度檢測

按照儀器默認的土壤設定參數，藍光折射率設為1.336，殘差均小于0.5%，遮光度為1.5%～4.5%。將燒杯中加滿蒸餾水，超聲3 min，排除儀器氣泡，防止影響測量結果。將甘草粉末加入測量燒杯中稀釋至粒度儀測量所需的體積占比（7%～15%），待溶液穩定且沒有粉末沉淀時，邊超聲邊進樣測量。

2.3 有效成分含量測定

含量測定參考文獻[17]方法，根據化合物類型（甘草酸類和甘草苷類）分別進行檢測。該方法在包括回收率、重復性及穩定性在內的方法學驗證實驗中均表現出良好的可靠性。

2.3.1 甘草酸類3 種皂苷類化合物（1～3）的檢測方法 稱取甘草粉末200 mg于50%甲醇10 mL，25 ℃超聲提取30 min。流動相為乙腈-甲醇（4∶1，A）和0.1%甲酸水溶液（B），洗脫梯度（0～1.0 min，30%A；1.0～8.0 min，30%～40%A；8.0～16.0 min，40%～52%A；16.0～16.2 min，52%～100%A；16.2～17.6 min，100%A）；流速0.40mL·min-1，柱溫55 ℃，進樣量1 μL，樣品盤溫度15 ℃，全波長掃描190～600 nm，定量分析檢測波長254 nm。

對照品溶液的配制：化合物1、2 溶于50%甲醇，化合物3 溶于適量75%甲醇，配制質量濃度為5 mg·mL-1的儲存液。用50%甲醇將化合物1和2稀釋至0.5 mg·mL-1，化合物3 稀釋至2.5 mg·mL-1，再按照1、1.25、2.5、5、10、20、40、80 和160 的稀釋因子進行稀釋，以峰面積為Y，各個化合物進樣質量（g）為X，獲得標準曲線。

2.3.2 甘草苷類8種黃酮苷類化合物（4～11）的檢測方法 按2.3.1項下方法提取樣品。流動相為乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～1.0 min，10%～15%A；1.0～6.0 min，15%～25%A；6.0～8.5 min，25%～30%A；8.5～10.0 min，30%～32%A）；流速為0.30 mL·min-1，化合物10 和11 檢測波長365 nm，化合物4～9檢測波長270 nm。

對照品溶液的配制：化合物4～11均溶于適量50%甲醇至質量濃度為3 mg·mL-1的儲存液，用50%甲醇分別稀釋化合物4～6和8到使用質量濃度0.18 mg·mL-1，化合物7、9～11質量濃度為0.42 mg·mL-1，再按照1、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160的稀釋因子進行稀釋，以峰面積為Y，各個化合物進樣質量（g）為X，獲得標準曲線。

2.4 數據分析

使用IBM SPSS 19.0 統計軟件對各化合物含量與甘草粉末粒度的相關性進行統計分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 甘草粉末粒度檢測結果

典型差異甘草樣品檢測結果見表2，計算出粉末樣品中粒徑在0.01～2.00、2.00～20.00、20.00～50.00、50.00～100.00、100.00～200.00、200.00～250.00、250.00～500.00、500.00～1000.00、1000.00～2000.00 μm 的體積占比，即粉末樣品的粒度分布，以此來表征甘草粉末的粉體特征。可見不同產地甘草樣品粒度分布存在明顯差異。

表2 甘草粉末粒度分布 %

40 份甘草粉末樣品的粒徑分布在2.00～20.00、20.00～50.00、50.00～100.00、100.00～200.00、250.00～500.00、500.00～1000.00 μm 幾個區段內的粒子體積占比較大（均值＞10%），且在40 個樣品當 中 2.00～20.00、50.00～100.00、100.00～200.00、500.00～1000.00 μm 幾個區段內的粒子分布體積的波動較大（波動＞10%），見表2。這些甘草粉末樣品在這些區段的分布可能與甘草的粉體特征和品質有關聯。

3.2 有效成分含量測定結果

3.2.1 標準曲線 各化合物質量濃度及色譜峰面積線性關系良好，見表3。

表3 甘草各化合物標準曲線的回歸方程

3.2.2 有效成分含量 《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版規定，甘草中甘草酸質量分數不得低于2%、甘草苷質量分數不得低于0.5%，根據測量值，40批甘草中甘草酸不合格率為32.5%，甘草苷不合格率為35.0%。甘草酸不合格的樣品產地主要集中在新疆，包括新疆29 團、30 團、和碩、精河、輪南和伊犁等地的部分樣品，并與等級無明顯相關。甘草苷不合格的樣品產地也主要集中在新疆，尤其以新疆29 團、30 團、輪南、精河、伊犁等地不合格比較嚴重。

諸多產地中甘肅榆中的一等甘草質量最佳，其甘草酸質量分數最高達4.68%、甘草苷質量分數最高達5.14%，在測定的成分中22-β-乙酰氧基-甘草酸、甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷均為峰值，且甘草皂苷G2質量分數為0.456 0%，僅次于內蒙古烏拉特前旗GC07-01樣品（0.468 1%），見表4。

表4 甘草中甘草酸及甘草苷類化合物質量分數 %

續表4

3.3 甘草酸及甘草苷類化合物與甘草粉末粒度的相關性

由表5可知，甘草粒度分布與有效成分的含量具有顯著相關性。在甘草粒徑分布在50.00～100.00、100.00～200.00、200.00～250.00 μm，粒子分布數越多，甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷、維采寧和異甘草苷的含量越低，且在100.00～200.00 μm，粒子分布越多，22-β-乙酰氧基-甘草酸的含量越高；但是在500.00～1000.00 μm，粒子分布越多，甘草苷及異甘草苷的含量越高；在1000.00～2000.00 μm，粒子分布越多，甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、維采寧和異甘草苷的含量均越高，僅22-β-乙酰氧基-甘草酸的含量越低。

提示甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷、維采寧和異甘草苷含量與50.00～250.00 μm 的粒子分布呈負相關，而與1000.00～2000.00 μm 分布的粒子呈正相關；甘草苷及異甘草苷的含量與500.00～1000.00 μm 分布的粒子呈正相關。根據3.1 項下結果，40份甘草粉末樣品的粒徑分布 在2.00～20.00、20.00～50.00、50.00～100.00、100.00～200.00、250.00～500.00、500.00～1000.00 μm幾個區段內的粒子分布體積占比較大（均值＞10%），由此可推測，甘草粉末粒徑在50.00～200.00、500.00～1000.00 μm 分布，與甘草質量直接相關。50.00～200.00 μm 分布越少，500.00～1000.00 μm分布越多，同時在更高的粒徑范圍內分布越多，甘草質量可能越好。

4 討論

本研究以甘草為研究對象引入粒度分析儀，分析了甘草粉末的粒度分布，測量結果準確、可靠，適用于將中藥材粉體特征鑒別指標客觀化、量化。通過分析甘草粉末粒度分布與有效成分含量之間的相關性，發現甘草粉末粒度分布與有效成分的含量具有顯著相關性，將粒度分布同中藥材品質相關聯，提供客觀的數據支持，為現代中藥鑒定數字化發展提供了新方法、新思路。

本研究統計甘草粉末樣品粒度分布體積占比大于10% 的區段，推測甘草粉末粒徑在50.00～200.00 μm 和500.00～1000.00 μm 的分布可用于表征甘草粉體特性，與甘草質量直接相關。相關性分析表明，甘草粉末粒徑在50.00～250.00 μm分布越少，500.00～1000.00 μm 及更高的粒徑范圍內分布越多，甘草質量可能越好。《中國藥典》2020年版（一部）規定粗粉指能全部通過二號篩[（850±29）μm]，但混有能通過四號篩[（250±9.9）μm]不超過40%的粉末；中粉是指能全部通過四號篩[（250±9.9）μm]，但混有能通過五號篩[（180±7.6）μm]不超過60%的粉末[1]。因此本研究結果表明，甘草粉末（粗粉）中滿足中粉要求（能通過四號篩）的體積占比越大，甘草酸和甘草苷等活性成分含量越低。

自古以來甘草以粉性為佳，但“粉性”科學內涵仍有待發掘，量化評價方法仍有待建立。本研究除了將粒度分布同甘草品質相關聯外，采用的技術和方法還可為“粉性”的量化提供參考，對揭示中藥辨狀論質方法學的本質有一定意義。