何首烏中大黃素-大黃素二蒽酮抗心肌缺血作用研究△

楊建波，汪祺a，王瑩，程顯隆，魏鋒，陳子涵，孫華*，高慧宇，王雪婷，宋云飛，馬雙成*

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.中國醫學科學院 藥物研究所，北京 100050

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根，生何首烏具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便等功效[1]；制何首烏具有補肝腎、益精血、烏須發、強筋骨等功效[1]。文獻報道，何首烏中化學成分主要有蒽醌（單核和雙核蒽醌）、二苯乙烯、黃酮、多酚及多糖類等[2-10]。現代藥理學研究發現，何首烏具有抗衰老、抗炎、調血脂、保肝、神經保護和抗糖尿病等作用[11-14]。何首烏水提取物作用于犬急性心肌缺血再灌注模型，能夠使血清中超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化酶（CAT）活性升高，有效縮小心肌梗死面積，對犬急性心肌缺血再灌注損傷具有良好的預防作用[15]。進一步研究發現，何首烏中主要活性成分二苯乙烯苷能夠顯著降低缺血再灌注模型心肌細胞中活性氧（ROS）含量，并進一步抑制細胞凋亡，發揮抗心肌缺血活性[16]。目前臨床心肌缺血的治療包括藥物治療、支架等的介入治療和冠狀動脈搭橋術等的手術治療。其中藥物治療主要包括硝酸酯類藥物、鎮痛劑、β受體阻斷劑、鈣通道阻斷劑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統藥物、調脂藥，以及丹參片、速效救心丸、銀杏葉制劑等中成藥，但這些藥物僅能用于緩解癥狀，難以徹底治愈[17-18]。

本課題組首次從何首烏中分離得到一類新的成分二蒽酮類成分，除了發現其在體外細胞和斑馬魚模型中表現出一定的肝毒性外[19-21]，還發現二蒽酮類成分具有較好的抗病毒和抗抑郁等活性[22-23]。因此，為了進一步豐富該類成分的藥理活性研究，本研究對分離得到的反式（順式）-大黃素-大黃素二蒽酮（圖1）混合樣品進行抗心肌缺血活性評價。

圖1 反式（順式）-大黃素-大黃素二蒽酮結構式

1 材料

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級雄性昆明種小鼠，38只，體質量18～20 g，購于北京華阜康生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0008，動物實驗由中國醫學科學院藥物研究所倫理委員會審批，審批號為00003037。動物飼養于中國醫學科學院藥物研究所良好實驗室管理規范（GLP）動物實驗中心，自由攝食、飲水，飼養溫度為（20±3）℃，相對濕度為（50.0±10.0）%，間隔12 h開燈光照。

1.2 試藥

異丙腎上腺素（ISO，批號：I5627-5G，Sigma 公司）；地爾硫卓（批號：E017，天津田邊制藥有限公司）；心肌肌鈣蛋白-T（cTn-T，批號：202011025016）、肌酸激酶-同工酶（CK-MB，批號：20210501033）酶聯免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒均購于上海紀寧實業有限公司；反式-大黃素-大黃素二蒽酮和順式-大黃素-大黃素二蒽酮對照品為實驗室制備（純度≥98%）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，天津市福晨化學試劑廠）；其他試劑均為分析純。

何首烏藥材樣品于2020年10月購于廣東省茂名市高州市，經中國食品藥品檢定研究院楊建波副研究員檢定為何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根，樣品標本（GDGZ2020）保存于中國食品藥品檢定研究院。

1.3 儀器

LC-6AD 型半制備高效液相色譜儀（日本島津公司）；e2695 型高效液相色譜儀，配2998 型光電二極管陣列檢測器（PDA）、Empower 色譜工作站（Waters 公司）；ZORSAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm，美國Agilent公司）；DM-8型大孔吸收樹脂（天津津達正源化工有限公司）；C18反相填料（日本YMC 公司）；XPE105型萬分之一電子分析天平、ME303/02 型千分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；VIM3000 型小動物專用吸入麻醉機（美國SurgiVet 公司）；MD3000-E 型心電圖檢測儀（安徽正華生物儀器設備公司）；Multiskan FC型酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）。

2 方法

2.1 大黃素-大黃素二蒽酮樣品的制備

取何首烏干燥塊根10 kg，粉碎后用70%乙醇加熱回流提取3 次，每次2 h，合并3 次提取液，減壓回收溶劑得70%乙醇浸出物（1.5 kg）。將上述浸出物混懸于水（1 L）中，再加水稀釋至5 L，過DM-8型大孔吸附樹脂，依次用水和不同體積分數的乙醇洗脫，得到3 個不同組分，分別為水洗脫部分（組分A）、55%乙醇洗脫部分（組分B）和95%乙醇洗脫部分（組分C）。組分C 用甲醇溶解，拌樣十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS），干法上樣，經ODS 中壓柱色譜分離，依次用50%甲醇、70%甲醇和甲醇洗脫，再經過反相硅膠薄層色譜檢測、合并，共獲得5 個組分，分別為C1～C5。組分C3（4.5 g）經過半制備液相色譜純化，流動相為甲醇-水（80∶20），檢測波長為230 nm，流速為5.0 mL·min-1，得到大黃素-大黃素二蒽酮樣品（1.5 g）。

2.2 大黃素-大黃素二蒽酮樣品分析

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORSAX SBC18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-水（75∶25）；柱溫為35 ℃；檢測波長為360 nm；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為10 μL。

2.2.2 對照品溶液配制 分別取反式（順式）-大黃素-大黃素二蒽酮對照品適量，精密稱定，加甲醇溶液制成含反式（順式）-大黃素-大黃素二蒽酮分別為0.31、0.32 mg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液配制 取大黃素-大黃素二蒽酮樣品適量，精密稱定，加甲醇溶液制成含大黃素-大黃素二蒽酮0.67 mg·mL-1的供試品溶液，即得。

2.2.4 含量測定 分別取對照品和供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣分析，結果顯示在對照品色譜峰保留時間的位置上，供試品溶液顯相同保留時間的色譜峰，見圖2。并進一步用外標法對供試品中反式（順式）-大黃素-大黃素二蒽酮進行含量測定，結果發現其質量分數分別為50.7%和35.8%，總質量分數為86.5%。

圖2 反式（順式）-大黃素-大黃素二蒽酮混合對照品和樣品的高效液相色譜圖

2.3 模型制備、分組與給藥

雄性昆明種小鼠適應環境后隨機分為4 組，分別為對照組、ISO 模型組、地爾硫卓（20 mg·kg-1）陽性對照組和大黃素-大黃素二蒽酮（10 mg·kg-1，根據預試驗結果確定劑量）組，每組9～10 只。大黃素-大黃素二蒽酮組小鼠每天灌胃給藥相應劑量的大黃素-大黃素二蒽酮1 次，地爾硫卓組每天腹腔注射給藥1 次，對照組及模型組給予相同量的CMC-Na溶液，給藥量均為10 mg·kg-1，連續給藥10 d。給藥第4 天，除對照組外，各組小鼠皮下注射ISO（40 mg·kg-1）1次，給藥第5～10天ISO皮下注射劑量調整為20 mg·kg-1，均為給藥后2 h 造模，第10天給予ISO造模2 h，眼眶取血后處理動物。

2.4 心電圖監測

實驗第10 天，每組小鼠隨機選取4 只，于造模0.5 h 后記錄Ⅱ導聯心電圖，并分析ST 段抬高的情況[24]。

2.5 心肌損傷生物標記物及心肌酶檢測

末次造模后2 h，小鼠眼眶靜脈叢取血，室溫靜置2 h后，3500 r·min-1離心20 min（離心半徑8.6 cm）分離血清，按ELISA 試劑盒說明書測定血清CK-MB和cTn-T水平[25]。

2.6 統計學分析

實驗數據均采用SPSS 13.0 軟件處理分析，組間比較用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大黃素-大黃素二蒽酮對ISO致心肌缺血小鼠Ⅱ導聯心電圖的影響

心電圖檢查是診斷心肌缺血最常用的無創性方法。ISO給藥引起小鼠心電圖出現ST段持續弓背抬高，表現出典型的心肌缺血性改變。計算ST 段抬高程度（ΔST），模型組與對照組比較顯著升高（圖3）。大黃素-大黃素二蒽酮10 mg·kg-1能顯著降低ISO引起的心電圖ST段抬高，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），且活性優于地爾硫卓（20 mg·kg-1）。

圖3 各組小鼠Ⅱ導聯心電圖ST段變化（±s, n=4）

3.2 大黃素-大黃素二蒽酮對ISO致心肌缺血小鼠血清心肌損傷生物標記物cTn-T的影響

心肌壞死時，心肌內含有的一些蛋白質類物質會從心肌組織內釋放出來，并出現在外周循環血中，可作為心肌損傷的判斷性指標。肌鈣蛋白（Tn）是心肌組織收縮的調節蛋白，心肌肌鈣蛋白（cTn）與骨骼肌中的Tn 在分子結構和免疫學上是不同的，因此是心肌所獨有的，是判斷心肌壞死最特異和敏感的首選標志物。cTn 有3 個亞型，分別為cTn-T、cTn-I 和cTn-C。cTn-T 對早期和晚期心肌壞死均具有很高的診斷價值。

各組小鼠血清中cTn-T 檢測結果見圖4。ISO 引起小鼠血清心肌損傷生物標記物cTn-T 水平顯著升高，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，大黃素-大黃素二蒽酮10 mg·kg-1能顯著降低小鼠血清cTn-T 水平（P＜0.05），且活性優于陽性對照藥地爾硫卓（20 mg·kg-1）。

圖4 各組小鼠血清中cTn-T水平（±s, n=4）

3.3 大黃素-大黃素二蒽酮對ISO致心肌缺血小鼠血清心肌酶CK-MB含量的影響

CK-MB 是判斷心肌壞死的另一個臨床特異性和敏感性指標。各組小鼠血清中CK-MB水平檢測結果見圖5。ISO 能引起小鼠血清CK-MB 水平顯著升高，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，大黃素-大黃素二蒽酮（10 mg·kg-1）能顯著降低ISO引起的血清CK-MB水平升高（P＜0.05），且活性優于陽性對照藥地爾硫卓（20 mg·kg-1）。

圖5 各組小鼠血清中CK-MB水平（±s, n=4）

4 討論

本課題組首次建立從何首烏中快速制備大黃素-大黃素二蒽酮的分離方法，并對其進行了抗心肌缺血活性篩選，初步確定其在10 mg·kg-1的劑量顯示較好的活性，且活性優于陽性對照藥地爾硫卓（20 mg·kg-1），為進一步深入系統地研究該類成分的藥理活性提供參考。在后續的研究中，一方面要分別考察反式、順式-大黃素-大黃素二蒽酮的抗心肌缺血活性，另一方面還需要考察其不同劑量的抗心肌缺血活性，進而獲得半數有效量，有助于系統評價其治療指數，從而評價該類成分的安全性。

與此同時，本課題組研究發現，何首烏中二蒽酮類成分為微量成分[26]，除了大黃素-大黃素二蒽酮，還存在40 余個潛在二蒽酮類成分[27]。為了進一步評價該類成分的抗心肌缺血活性及其作用機制，有必要對該類成分進行靶向分離與純化，從而闡明何首烏抗心肌缺血活性的潛在物質基礎，進一步為其臨床應用提供依據。