CTRP9對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠的干預效果及作用機制研究

謝駿 溫鑫 高鳳敏 楊驕霞 郭繼芳

急性心肌梗死是一種臨床常見的心肌組織細胞壞死性疾病，其主要誘因為冠狀動脈持續性供血、供氧不足，患者主要臨床表現為長時間的胸骨后劇烈疼痛[1，2]。我國每年新增急性心肌梗死病例數居高不下。溶栓、手術、介入等均為臨床常用的治療手段，有學者表示，部分急性心肌梗死患者治療過程中出現心肌組織損傷程度加劇的情況，即為再灌注損傷，有研究表明，再灌注損傷會使患者心肌損傷程度更加嚴重，嚴重威脅患者生命安全[3，4]。目前臨床尚無特效的治療心肌缺血再灌注損傷的手段，因此越來越多的專家學者開始致力于心肌缺血再灌注損傷治療方法的研究[5]。CTRP9 是一種新型脂肪因子，主要表達于機體心肌組織，具有抗炎、促進血管舒張等作用，但是關于其在心肌缺血再灌注損傷中的研究鮮有報道[6]。本研究建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，調控CTRP9 表達，旨在探究CTRP9 對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠的干預效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料選取40 只SD 健康雄性大鼠[哈爾濱國生生物科技股份有限公司，使用許可證號：SYXK（黑）2021-002]，年齡10～14 周，平均（11.9±1.7）周；體重235～279g，平均（257.3±17.6）g。所有大鼠于（22.9±1.5）℃環境中喂養。本研究獲我院倫理委員會批準。

主要試劑：ago CTRP9、antago CTRP9（上海國藥集團化學試劑有限公司）；大鼠抗小鼠TNF-α、IL-6 抗體（Gibco 公司）；小鼠抗兔LPO、CAT 抗體（Hyclone 公司）；兔抗大鼠Wnt3a、β-catenin 抗體（Invitrogen 公司）；大鼠抗小鼠AMPK 抗體（Selleck公司）；兔抗大鼠p38MAPK 抗體（BD 公司）；小鼠抗兔PPARγ 抗體（Sigma 公司）。

1.2 分組干預隨機選取10 只大鼠為正常組，不做處理。其余30 只大鼠建立心肌缺血再灌注損傷模型：麻醉處理大鼠，使用心電圖對大鼠進行心電監測。于大鼠左胸第4 肋間隙開胸，使大鼠心臟顯露于術野，將大鼠左心耳下2mm 位置左冠狀動脈前降支結扎，同時觀察心電圖，ST 段抬高表示缺血建立成功，45min 后將結扎縫線去除，再灌注2h。建模過程中大鼠死亡3 只，建模成功27 只。將27只心肌缺血再灌注損傷大鼠隨機分為模型組、下調組、上調組各9 只，下調組大鼠腹腔注射antago CTRP9 30mg/kg，上調組大鼠腹腔注射ago CTRP9 30mg/kg，正常組、模型組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 指標監測

1.3.1 LVEDd、LVESd 水平檢測 對各組大鼠進行麻醉處理，剃除大鼠胸部體毛，以30°仰臥體位進行固定，將超聲探頭置于左胸骨，與中線夾角20°，對大鼠LVEDd、LVESd 水平進行檢測。

1.3.2 酶標分析儀檢測氧化應激、炎癥指標水平 取各組大鼠腹部靜脈血3ml，2 000r/min 離心15min后-50℃保存。標記酶標板，準備標準品并進行稀釋，設置三孔分別標記為對照1、對照2、觀察孔，對照1 孔加入顯色劑及終止液，對照2 孔加入制備的標準品，觀察孔加入血清標本及抗體，三孔封膜、振蕩后置于37℃保溫箱培養2.5h，添加顯色劑，顯色后添加終止液，計算LPO、CAT、TNF-α、IL-6 水平。

1.3.3 HE 染色 各組大鼠全麻處理，采用頸部脫臼法處死，取大鼠心臟組織進行清洗，固定后浸泡于4%甲醛1d，石蠟包埋、切片后脫蠟，使用不同濃度酒精復水，清洗3min 后蘇木素染色，之后進行分化、氨水藍化，沖洗后伊紅染色、乙醇梯度脫水、脫蠟后封片，顯微鏡下觀察。

1.3.4 心肌梗死體積、心肌細胞凋亡率計算 取各組大鼠心肌組織切片，置于1% TTC 溶液中，在室內避光環境中孵育0.5h，使用BI-2000 醫用圖像分析系統對梗死體積百分比進行計算。TUNEL 法檢測心肌組織細胞凋亡率。

1.3.5 Wnt/β-catenin 通路、AMPK/p38MAPK/PPAR通路蛋白相對表達量檢測 使用Western blot 法檢測。裂解待測標本，提取50μg 蛋白，蛋白定量后行SDS-PAGE 凝膠電泳、轉膜，封閉2h 后添加一抗（1:2000）4℃孵育1d，使用PBS 液清洗3 次后添加二抗（1:5000），孵育1h 后PBS 液清洗3 次，顯色、曝光、成像，檢測條帶灰度值，計算Wnt3a、β-catenin、AMPK、p38MAPK、PPARγ 相對表達量。

1.4 統計學方法使用SPSS 26.0 軟件分析，計量資料以±s描述，多組對比行F檢驗，組間對比行獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌組織病理學觀察正常組大鼠心肌組織細胞形態規則、正常，排列整齊緊密，無細胞破損情況；模型組、下調組大鼠心肌組織細胞排列雜亂，出現較多膠原纖維，且出現嚴重的細胞膜受損情況；上調組大鼠心肌組織細胞排列雜亂情況明顯改善，炎性細胞減少。見圖1。

2.2 各組大鼠LVEDd、LVESd 水平比較模型組、下調組大鼠LVEDd、LVESd 水平高于正常組，且下調組大鼠LVEDd、LVESd 水平高于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；上調組大鼠LVEDd、LVESd 水平低于模型組、下調組，高于正常組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠LVEDd、LVESd 水平比較（±s，mm）

表1 各組大鼠LVEDd、LVESd 水平比較（±s，mm）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與下調組比較，cP＜0.05

組別 n LVEDd LVESd正常組 10 6.65±0.67 4.21±0.35模型組 9 10.63±1.58a 7.15±0.82a下調組 9 13.47±2.12ab 8.62±1.29ab上調組 9 8.52±1.05abc 5.32±0.55abc

2.3 各組大鼠氧化應激、炎癥指標水平比較模型組、下調組大鼠LPO、TNF-α、IL-6 水平高于正常組，CAT 水平低于正常組，且下調組大鼠LPO、TNF-α、IL-6 水平高于模型組，CAT 水平低于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；上調組大鼠LPO、TNF-α、IL-6 水平高于正常組，低于模型組、下調組，CAT 水平低于正常組，高于模型組、下調組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠氧化應激、炎癥指標水平比較（±s）

表2 各組大鼠氧化應激、炎癥指標水平比較（±s）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與下調組比較，cP＜0.05

組別 n LPO（mmol/L）IL-6（pg/ml）正常組 10 5.26±0.85 83.29±9.15 3.19±0.61 6.58±0.79模型組 9 15.33±2.34a 63.05±6.54a 12.28±2.27a 19.33±2.53a下調組 9 19.18±2.67ab 52.19±6.13ab 16.41±2.52ab 24.16±2.79ab上調組 9 8.12±1.52abc 75.13±8.52abc 5.63±1.52abc 11.21±1.78abc CAT（U/ml）TNF-α（ng/L）

2.4 各組大鼠心肌梗死體積比例、心肌細胞凋亡率比較模型組、下調組大鼠心肌梗死體積比例、心肌細胞凋亡率高于正常組，且下調組大鼠心肌梗死體積比例、心肌細胞凋亡率高于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；上調組大鼠心肌梗死體積比例、心肌細胞凋亡率低于模型組、下調組，高于正常組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠心肌梗死體積比例、心肌細胞凋亡率比較（±s，%）

表3 各組大鼠心肌梗死體積比例、心肌細胞凋亡率比較（±s，%）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與下調組比較，cP＜0.05

組別 n 梗死體積比例 凋亡率正常組 10 0.00±0.00 3.98±0.64模型組 9 35.26±4.17a 19.52±2.33a下調組 9 41.32±4.53ab 25.16±2.68ab上調組 9 16.37±2.76abc 9.68±1.21abc

2.5 各組大鼠Wnt/β-catenin 通路蛋白表達比較模型組、下調組大鼠Wnt3a、β-catenin 表達高于正常組，下調組大鼠Wnt3a、β-catenin 表達高于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；上調組大鼠Wnt3a、β-catenin 表達高于正常組，低于模型組、下調組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表4、圖2。

表4 各組大鼠Wnt/β-catenin 通路蛋白表達對比（±s）

表4 各組大鼠Wnt/β-catenin 通路蛋白表達對比（±s）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與下調組比較，cP＜0.05

組別 n Wnt3a β-catenin正常組 10 0.98±0.11 1.02±0.15模型組 9 1.63±0.25a 1.65±0.23a下調組 9 1.86±0.32ab 1.89±0.29ab上調組 9 1.21±0.16abc 1.25±0.19abc

2.6 各組大鼠AMPK/p38MAPK/PPAR 通路蛋白表達對比模型組、下調組大鼠AMPK、PPARγ 表達低于正常組，p38MAPK 表達高于正常組，且下調組大鼠AMPK、PPARγ 表達低于模型組，p38MAPK表達高于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；上調組大鼠AMPK、PPARγ 表達低于正常組，高于模型組、下調組，p38MAPK 表達高于正常組，低于模型組、下調組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表5、圖3。

表5 各組大鼠AMPK/p38MAPK/PPAR 通路蛋白表達對比（±s）

表5 各組大鼠AMPK/p38MAPK/PPAR 通路蛋白表達對比（±s）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與下調組比較，cP＜0.05

組別 n AMPK p38MAPK PPARγ正常組 10 1.01±0.12 1.05±0.14 0.98±0.10模型組 9 0.62±0.07a 1.56±0.22a 0.53±0.06a下調組 9 0.49±0.06ab 1.82±0.25ab 0.41±0.05ab上調組 9 0.85±0.09abc 1.23±0.16abc 0.75±0.08abc

3 討論

作為常見的心血管疾病，急性心肌梗死具有發病急、預后差的特點[7]。中老年人群為急性心肌梗死高發群體，急性心肌梗死已經成為威脅中老年人群生命安全的主要疾病。臨床常使用介入、溶栓等手段對急性心肌梗死患者進行治療，但具有一定的再灌注損傷風險，再灌注損傷也是影響急性心肌梗死患者預后的主要因素[8，9]。有研究表明，心肌缺血再灌注損傷是一種較復雜的病理過程，病情嚴重的會導致不可逆的心肌組織細胞凋亡[10，11]。CTRP9是一種新型脂肪因子，具有保護內皮細胞、擴張血管、抗炎等多種作用。CTRP9 表達變化與急性心肌梗死嚴重程度具有密切聯系，但是關于其在心肌缺血再灌注損傷病理發展過程中作用的研究還鮮有報道。

心肌缺血再灌注損傷的發生發展會導致心室重構，對機體心功能造成嚴重威脅[12，13]。有學者在研究中表示，心肌缺血再灌注損傷的嚴重程度與機體左室功能具有密切聯系[14]。LVEDd、LVESd 常用于評價機體心功能。本研究顯示，與正常大鼠相比，心肌缺血再灌注損傷模型大鼠LVEDd、LVESd 水平較高，說明隨著心肌缺血再灌注損傷的發展，大鼠出現心室重構，心功能受到明顯損傷。本研究還發現，上調CTRP9 表達的心肌缺血再灌注損傷大鼠LVEDd、LVESd 水平明顯下降，說明上調CTRP9 表達能夠改善大鼠心室重構狀況，從而促進大鼠心功能恢復，可能是因為CTRP9 能夠緩解動脈粥樣硬化、擴張血管，從而改善心肌梗死、再灌注損傷嚴重程度。

有研究表明，氧化應激、炎癥反應均為心肌缺血再灌注損傷發展的主要誘因，抑制機體心肌組織氧化應激、炎癥反應，能夠減輕心肌缺血再灌注損傷嚴重程度，對機體心功能恢復、預后改善具有積極作用[15，16]。本研究顯示，心肌缺血再灌注損傷模型大鼠LPO、TNF-α、IL-6 水平較高，CAT 水平較低，上調CTRP9 表達的心肌缺血再灌注損傷大鼠LPO、TNF-α、IL-6 水平明顯下降，說明心肌缺血再灌注損傷癥狀的發展伴隨著一定程度的氧化應激、炎癥反應，上調CTRP9 表達能夠減輕氧化應激、炎癥反應嚴重程度，從而抑制心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織損傷，起到改善大鼠心功能的作用。

心肌缺血再灌注損傷的發生發展伴隨著心肌細胞凋亡，從而造成大鼠心功能嚴重損傷[17]。本研究顯示，心肌缺血再灌注損傷模型大鼠凋亡率較高，上調CTRP9 表達的心肌缺血再灌注損傷大鼠梗死體積比例、凋亡率明顯下降，說明上調CTRP9 表達能夠改善大鼠心肌組織損傷嚴重程度，抑制心肌組織細胞凋亡，可能是因為上調CTRP9 表達調控細胞凋亡通路蛋白表達。Wnt/β-catenin 為廣譜的細胞凋亡通路，主要配體Wnt3a、β-catenin 表達與細胞凋亡、增殖能力變化密切相關[18，19]。本研究顯示，心肌缺血再灌注損傷大鼠Wnt3a、β-catenin 相對表達量較高，上調CTRP9 表達的心肌缺血再灌注損傷大鼠Wnt3a、β-catenin 相對表達量明顯下降，說明上調CTRP9 表達能夠調控Wnt/β-catenin 通路蛋白表達，抑制大鼠心肌組織細胞凋亡，從而緩解大鼠心肌損傷嚴重程度。

有研究表明，AMPK 信號通路在心肌缺血再灌注損傷發生發展過程中發揮重要作用，激活AMPK信號通路能夠減輕心肌組織細胞氧化應激損傷，抑制細胞凋亡，從而起到減輕再灌注損傷嚴重程度的作用[20，21]。本研究顯示，心肌缺血再灌注損傷大鼠AMPK、PPARγ 表達較低，p38MAPK 表達較高，上調CTRP9 表達的心肌缺血再灌注損傷大鼠AMPK、PPARγ 表達上調，p38MAPK 表達下調，說明上調CTRP9 表達激活AMPK 信號通路，從而起到減輕心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌損傷、改善大鼠心功能的作用。

綜上所述，上調心肌缺血再灌注損傷大鼠CTRP9表達，能夠改善大鼠心室重構，減輕大鼠心肌組織氧化應激損傷、炎癥反應，抑制心肌細胞凋亡，其機制可能是調控Wnt/β-catenin 通路、AMPK/p38 MAPK/PPAR 通路蛋白表達，為心肌缺血再灌注損傷的臨床治療提供一定的參考依據。