基于VIP-cAMP-PKA-AQP8通路探討痛瀉要方對腹瀉型腸易激綜合征的治療機制

李賀元 陳偉剛 熊阿琴 張雁

腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是臨床常見的一種胃腸道功能紊亂性疾病，患者多表現為腹痛、腹部不適、大便性狀改變等癥狀，給身心健康和日常生活質量帶來不利影響。根據羅馬Ⅲ診斷標準，IBS 可分為腹瀉型（IBS-D）、便秘型（IBS-C）、交替型及不確定型，其中以IBS-D 最為常見。有研究指出[1，2]，水通道蛋白-8（Aquaporin-8，AQP8）表達減少與IBS-D 患者腹瀉、便秘等臨床癥狀有關，而血管活性腸肽（Vasoactive intestinal peptide，VIP）可通過調控細胞蛋白激酶系統（PKA-cAMP 通路）改變AQP8含量，進而促進IBS-D 的發生發展。在臨床治療方面，目前西醫對于IBS-D 尚無特效藥物，主要以飲食干預、對癥治療等方式為主，但存在療程長、病情反復發作等缺點。痛瀉要方是臨床治療IBS-D 的常用中藥處方，可有效促進小腸吸收功能恢復，改善患者臨床癥狀[3]。有動物實驗研究發現[4]，痛瀉要方治療IBS-D 的機制可能與結腸中水通道蛋白含量改變密切相關。為此，本研究基于VIP-cAMP-PKA-AQP8通路探討痛瀉要方對IBS-D 的治療機制，以期為IBS的相關研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1 一般資料選取2020年7月～2021年8月在我院治療的106 例IBS 患者為研究對象，根據羅馬Ⅲ診斷標準和IBS 亞型分型標準將其分為IBS-D 組（n=74）和IBS-C 組（n=32）。IBS-D 組中男31 例，女43 例；年齡23～64 歲，平均（43.61±5.73）歲；體質指數（BMI）19.4～27.1kg/m2，平均（23.41±2.29）kg/m2。IBS-C組中男13 例，女19 例；年齡25～63 歲，平均（42.98±6.04）歲；BMI 19.8～26.7kg/m2，平均（23.21±2.06）kg/m2。同期選取30 例健康志愿者作為健康對照組，其中男13 例，女17 例；年齡25～64 歲，平均（42.47±5.91）歲；BMI 19.5～26.9kg/m2，平均（23.36±2.11）kg/m2。三組研究對象性別、年齡、BMI 等基線資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 納入與排除標準IBS 患者納入標準：①符合羅馬Ⅲ診斷標準和IBS 亞型分型標準[5]；②IBS-D 患者符合《腸易激綜合征中醫診療共識意見》中肝郁脾虛證的中醫辨證診斷標準[6]；③年齡18～65 歲；④臨床資料齊全；⑤患者及家屬對治療方式、檢查項目等知情同意；⑥依從性良好。排除標準：①器質性病變者；②其他原因導致的非功能性腸病者；③心、肝、腎、血液、腦部等重要臟器或系統患有嚴重疾病者；④精神疾病或嚴重意識障礙者；⑤過敏體質或對本研究用藥過敏者；⑥妊娠期或哺乳期女性。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR 檢測AQP8 mRNA、VIP mRNA 表達三組研究對象均行結腸鏡檢查，并在降結腸取標本2 份，標本取得后快速放入液氮罐中保存待測。從液氮罐中取出標本，按50mg 標本：1ml TRIzol 溶液的比例加入TRIzol 溶液（購置于美國Ambion 公司）。隨后按照TRIzol 說明書提取組織RNA，將提取出的RNA 逆轉錄為cDNA，并取cDNA 進行RT-PCR。AQP8 反應體系為：SYBR Premix Ex Taq（購置于日本TaKaRa 公司）10μl，上游引物、下游引物各0.8μl（上游引物：5'-TCATTGGAGTGGGAAGACC-3'，下引物：5'-TGAGAAGCAAGGAAGTGGC-3'），cDNA 2.0μl，二次蒸餾水6.4μl；反應條件為：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 20s，40 個循環。VIP 反應體系為：SYBR Pre mix Ex Taq（購置于日本TaKaRa 公司）10μl，上游引物、下游引物各0.2μl（上游引物：5'-TAATGGTGG ACCGCAACAAC-3'，下游引物：5'-GTGAGCACTGAAG CGAAAGC-3'），cDNA 2.0μl，二次蒸餾水7.2μl；反應條件為：94℃ 45s，60℃ 30s，72℃ 60s，35 個循環。最后計算CT 值和溶解曲線，獲取AQP8 mRNA、VIP mRNA 的相對表達量。

1.3.2 免疫組化法檢測蛋白激酶A（PKA）表達 將取得的組織標本固定、切片后以3%過氧化氫溶液孵育10min，隨后采用磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每次5min，封閉后在溫室下孵育30min。依次加入一抗（1:400）、二抗（1:5 000），并以磷酸鹽緩沖液沖洗3次，經DAB 顯色后封片，于光鏡下觀察。

1.3.3 放射免疫法檢測環磷酸腺苷（cAMP）表達 將50mg 組織標本加入冰醋酸、無水乙醇混勻后靜置5min，以3 500r/min 的條件離心處理15min，取上清液保存。隨后將殘渣加入75%乙醇，勻漿分散，再以3 500r/min 的條件離心處理15min，再合并上清液進行檢測。檢測過程嚴格按照cAMP 試劑盒說明書執行。

1.3.4 治療方法 74 例IBS-D 患者均給予中藥痛瀉要方治療，具體用藥方案：基本方為炒白術20g、陳皮12g、防風10g、白芍20g；兼肝郁者加用柴胡、香附；脾虛甚者加茯苓、炒山藥、砂仁；兼有腎陽虛者加五味子、肉豆蔻、補骨脂；痛甚者加延胡索、白芍加至30g；心神不安者加合歡花、合歡皮、夜交藤。上述所有藥物均由本院煎藥室統一熬成湯劑，每劑藥物取湯汁300ml，分裝2 袋，早晚空腹各服用1袋，連續治療1 個月。

1.4 評價指標①比較三組研究對象結腸黏膜AQP8 mRNA、VIP mRNA 表達水平，并分析AQP8、VIP 基因表達的相關性。②比較IBS-D 患者治療前后AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 以及cAMP 表達水平。③治療1 個月后，參考《腸易激綜合征中醫診療共識意見》對IBS-D 組患者進行療效評估。治療后患者癥狀、體征消失，證候積分減少幅度≥90%，判定為痊愈；治療后患者癥狀、體征明顯改善，證候積分減少幅度為60%～89%，判定為顯效；治療后患者癥狀、體征有所好轉，證候積分減少幅度為30%～59%，判定為有效；未達上述標準者，判定為無效。比較不同療效患者AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA、cAMP 表達水平，并分析臨床療效與各指標的相關性。

1.5 統計學方法采用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據處理，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析；相關性分析采用Pearson 檢驗；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組研究對象AQP8 mRNA、VIP mRNA 表達水平比較IBS-D 組AQP8 mRNA 表達水平低于IBS-C 組和健康對照組，VIP mRNA 表達水平高于IBS-C 組和健康對照組；IBS-C 組AQP8 mRNA、VIP mRNA 表達水平均高于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 三組研究對象AQP8 mRNA、VIP mRNA 表達水平比較（±s）

表1 三組研究對象AQP8 mRNA、VIP mRNA 表達水平比較（±s）

注：與健康對照組比較，*P＜0.05；與IBS-C 組比較，△P＜0.05

組別 n AQP8 mRNA VIP mRNA IBS-D 組 74 0.58±0.16△* 6.94±2.17△*IBS-C 組 32 1.25±0.32* 6.01±1.93*健康對照組 30 0.91±0.22 2.39±0.89 F 3.974 4.264 P 0.018 0.011

2.2 AQP8 mRNA 與VIP mRNA 表達的相關性Pearson 相關性分析顯示，AQP8 mRNA 與VIP mRNA 的表達量呈負相關（r=-0.534，P=0.000）。見圖1。

2.3 IBS-D 組患者治療前后AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 及cAMP 表達水平比較治療后，IBS-D 組患者AQP8 mRNA 表達水平高于治療前，VIP mRNA、PKA、cAMP 表達水平低于治療前，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 IBS-D 組患者治療前后AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 及cAMP 表達水平比較（±s）

表2 IBS-D 組患者治療前后AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 及cAMP 表達水平比較（±s）

時間 n AQP8 mRNA VIP mRNA PKA cAMP治療前 74 0.58±0.16 6.94±2.17 0.78±0.25 0.54±0.22治療后 74 0.84±0.24 4.65±2.03 0.42±0.13 0.31±0.15 t 7.754 6.629 10.990 7.431 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 不同療效患者AQP8 mRNA、VIP mRNA 、PKA及cAMP 表達水平比較IBS-D 組患者服用痛瀉要方治療1 個月后，痊愈23 例，顯效27 例，有效18例，無效6 例，治療有效率為91.9%。不同療效患者AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 及cAMP 表達水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同療效患者AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 及cAMP 表達水平比較（±s）

表3 不同療效患者AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 及cAMP 表達水平比較（±s）

療效 n AQP8 mRNA VIP mRNA PKA cAMP痊愈 23 0.96±0.29 3.27±1.05 0.23±0.09 0.21±0.07顯效 27 0.81±0.35 4.59±2.23 0.39±0.11 0.29±0.10有效 18 0.63±0.25 5.65±2.07 0.59±0.20 0.37±0.16無效 6 0.51±0.21 6.04±1.94 0.68±0.26 0.52±0.08 F 5.136 10.256 7.461 9.577 P 0.007 0.000 0.000 0.000

2.5 AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 及cAMP 表達水平與療效相關性Pearson 相關性分析顯示，AQP8 mRNA 表達與療效呈正相關（r=0.671，P=0.007），而VIP mRNA、PKA、cAMP 表達與療效呈負相關（r=-0.423、-0.545、-0.397，P=0.011、0.010、0.023）。

3 討論

近年來，隨著社會經濟的快速發展以及人們飲食習慣的改變，IBS 發病率逐年升高，給患者生活、學習、工作、社交等帶來了極大影響。有報道指出[7]，我國IBS 臨床發病率為5.6%～11.5%，而在消化科門診患者中占比高達10.7%～34.3%。在中醫學上，IBS 屬于“腹痛”、“泄瀉”之范疇，其發病與外邪入侵、情志失調、體質虛弱、腸道失潤等有關。古籍《素問·舉痛論》云：“寒邪客于小腸，小腸不得成聚，故后泄腹痛矣”，認為飲食不節、腑臟虛弱導致氣機郁滯，進而通降功能失調，脾失健運而出現腹部不適等癥狀。因此，在治療方面當以“疏肝健脾、滲濕止瀉”為原則。痛瀉要方是以炒白術、陳皮、防風、白芍為基礎方的加味中藥處方，輔以柴胡、茯苓、炒山藥、五味子、肉豆蔻、補骨脂等藥物可以發揮調和肝脾之功效。本研究中，IBS-D 組患者服用痛瀉要方治療1 個月后，治療有效率為91.9%，與劉小軍等[8]研究結果相近。

目前，盡管痛瀉要方治療IBS 的臨床效果已得到諸多臨床研究證實和肯定[9，10]，但關于痛瀉要方對IBS 的具體作用機制研究較少。IBS-D 作為最常見的一種IBS 分型，其發病因素和機制較為復雜，有研究指出[11]，經神經-內分泌-免疫系統導致的水代謝異常和腸道平滑肌運動障礙是導致IBS-D腹瀉、腹痛的主要因素。水通道蛋白（AQPs）是一類結構、功能相似的膜蛋白，其成員AQP1、AQP3、AQP8 等均與腸道水運輸密切相關。Zhao 等[12]研究指出，AQPs 含量的改變可通過影響腸道水液代謝和水運輸過程，進而促使IBS-D 患者腹瀉癥狀加重。另外，也有研究證實[13]，AQP8 在人結腸黏膜廣泛表達，該蛋白的下調可損害活性結腸炎中的水分吸收，導致水樣腹瀉的發生。本研究結果顯示，IBS-D 組患者AQP8 mRNA 表達低于IBS-C 組和健康對照組，而IBS-C 組AQP8 mRNA 表達高于健康對照組。由此可見，AQP8 mRNA 表達降低，水分吸收減少，患者表現出腹瀉癥狀，AQP8 mRNA 表達增加，水分吸收增加，患者表現出便秘癥狀，與邱侶侶等[14]研究結果一致。

AQP8 表達調控的相關研究表明[15]，VIP 是調控AQPs 的重要神經遞質，其可直接調控人結腸上皮AQP8 的表達，影響水運輸環節。在本研究中，Pearson 相關性分析顯示，VIP mRNA 與AQP8 mRNA 表達水平呈負相關，提示VIP mRNA 表達降低可調節AQP8 蛋白含量升高，進而改善腸道水液代謝異常。此外，在有關VIP 調控AQP8 表達的信號途徑方面，近年來有研究認為[16，17]，VIP 可能是介導cAMP-PKA 信號通路參與了AQPs 表達的調控，進而維持機體水代謝穩態，促進IBS 患者癥狀改善。AQPs 均含有PKA 磷酸化的同源序列，這些AQPs上的絲氨酸受磷酸化作用后可調節AQPs 的運輸、門控，從而改變膜的水通透性。VIP 屬于一種神經調節肽，對胃腸道的運動和分泌功能具有調節作用，其可與G 蛋白耦聯跨膜受體結合，進而激活腺苷酸環化酶，促進cAMP 的釋放。cAMP 的增加可活化PKA，進而催化AQPs 上的絲氨酸磷酸化，增加膜的水通透性。

痛瀉要方是治療IBS-D 的常用處方，本研究分析了痛瀉要方對IBS-D 的藥理機制。許惠娟等[18]研究表明，痛瀉要方可能通過VIP 途徑提高AQP8的表達而發揮治療功效。本研究結果顯示，治療后IBS-D 組患者AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA、cAMP 表達與治療前比較差異均有統計學意義，且AQP8 mRNA 表達與療效呈正相關，而VIP mRNA、PKA、cAMP 表達與療效呈負相關。上述結果提示痛瀉要方對IBS-D 患者機體AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA、cAMP 表達有明顯影響，其藥理機制可能與VIP-cAMP-PKA-AQP8 通路有關。

綜上所述，IBS 患者癥狀與AQP8 mRNA、VIP mRNA 表達密切相關，痛瀉要方可能是基于VIPcAMP-PKA-AQP8 通路發揮其藥理作用，實現改善患者臨床癥狀的治療目標。