放置時間對大鼠血清樣本中電解質(zhì)含量及pH 值的影響

馮丁山, 黃業(yè)宇, 張曉昕, 吳愛琴, 王 湛, 蘇林梁

(海南省疾病預(yù)防控制中心,海口 570203)

電解質(zhì)是反映實驗動物健康狀況的重要而敏感的指標(biāo)，也是食品安全風(fēng)險評估中毒理實驗的重要評價指標(biāo)。水和電解質(zhì)廣泛分布在細(xì)胞內(nèi)外，參與體內(nèi)許多重要的功能和代謝活動，對維持正常生命活動起著非常重要的作用［1-2］。電解質(zhì)檢測中許多指標(biāo)是離子濃度，對外界影響因素比較敏感?，F(xiàn)階段對電解質(zhì)檢測結(jié)果影響因素的研究主要還是集中在人體樣本方面，對實驗動物樣本電解質(zhì)檢測結(jié)果影響因素的研究還很少，而且也不全面［3-4］。在動物標(biāo)本的采集與檢測過程中，經(jīng)常會把不同時間收到的標(biāo)本集中檢測。有文獻(xiàn)顯示在人的血清電解質(zhì)指標(biāo)檢測過程中，儲存時間對其檢測結(jié)果有明顯的影響［5］。本研究采用廣泛應(yīng)用于藥理、毒理、腫瘤等生物科學(xué)各個領(lǐng)域的常用實驗動物SD 大鼠，通過標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程鎖定選用的麻醉劑、采血管、樣本的種類和類型，采集血清樣本后進(jìn)行測定觀察，比較實驗動物血清樣本不同放置時間對電解質(zhì)指標(biāo)檢測結(jié)果的影響，從而建立數(shù)據(jù)庫，為實驗動物SD大鼠的電解質(zhì)指標(biāo)檢測結(jié)果判定提供依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件

SPF級SD大鼠40只，1月齡，體質(zhì)量為60～70 g，雌雄各半，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供［SCXK （湘） 2019-0014］， 質(zhì) 量 合 格 證 號 為430726211100268255。檢疫觀察5 d后適應(yīng)性飼養(yǎng)。飼料由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供［SCXK（湘）2019-0013］，質(zhì)量合格證號為4307372100001621。實驗動物飼養(yǎng)于海南省疾病預(yù)防控制中心［SYXK（瓊）2020-0021］。動物實驗室環(huán)境溫度為20～26 ℃，12 h晝夜交替光照，相對濕度為40%～70%。動物實驗方案經(jīng)海南省疾病預(yù)防控制中心動物管理委員會審查批準(zhǔn)（編號：HICDC/CX18-02）。

1.2 實驗儀器

梅州康立K-Lite8G 電極式電解質(zhì)分析儀（包含自動校正）購自梅州康立高科技有限公司，儀器參加省級臨檢中心室間比對，測定前按要求對儀器進(jìn)行保養(yǎng)和校正。電子計重秤購自常熟市雙杰測試儀器廠，電子天平購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，離心機(jī)為德國Eppendorf公司。

1.3 試劑

電解質(zhì)分析儀原裝配套試劑為梅州康立高科技有限公司產(chǎn)品；戊巴比妥鈉購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 方法

適應(yīng)性飼養(yǎng)至大鼠體質(zhì)量約90 g后，單籠正常喂養(yǎng)28 d，分別編號稱重后采血［6］。采血前動物禁食16 h，自由飲水。根據(jù)操作規(guī)程，選擇含2%戊巴比妥鈉的生理鹽水（即0.9%氯化鈉）溶液進(jìn)行動物麻醉，注射劑量為50 mg/kg（麻醉藥質(zhì)量/動物體質(zhì)量）。選用帶分離膠的5 mL 采血管通過腹腔靜脈采血，采血量最少3.5 mL。采血后放置30 min，以3 000 r/min 離心10 min，盡快分離血清備用。采血環(huán)境為空調(diào)控溫，溫度26 ℃。血清樣本加蓋后存放于2～8 ℃冰箱中，分別于采樣離心后0 h、2 h、4 h、6 h、24 h、48 h和120 h這7 個時間點測定K+、Na+、Ca2+和Cl-含量共4 項電解質(zhì)指標(biāo)以及pH值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 動物生長情況

實驗期間，動物被毛光滑，活動正常，攝食、飲水正常，生長良好。表1 顯示雌雄大鼠均體質(zhì)量增長正常，不同性別之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示大鼠生長狀況良好，可用于電解質(zhì)指標(biāo)檢測。

表1 實驗期間大鼠的體質(zhì)量Table 1 Weight of rats during the test（m/g, x± s）

2.2 電解質(zhì)和pH值測定結(jié)果

用Grubbs 法剔除了檢測數(shù)據(jù)中1 只雌鼠的異常值（即根據(jù)Grubbs算法檢測的離群值）后，將不同時間點的檢測結(jié)果分別與“0 h”時檢測結(jié)果比較，雌雄鼠分別統(tǒng)計。表2 結(jié)果提示雌、雄大鼠電解質(zhì)指標(biāo)檢測結(jié)果經(jīng)分析隨時間變化的趨勢一致：放置48 h后Cl-含量隨時間推移逐漸升高（除雄鼠120 h 略有波動），放置24 h 后Ca2+含量隨時間推移逐漸降低（雄鼠24 h 除外），放置2 h后pH值隨時間推移逐漸升高。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，與0 h 檢測結(jié)果比較，放置48 h 和120 h 的Cl-含量明顯升高（P＜0.05），放置48 h 和120 h 的Ca2+含量明顯降低（P＜0.05），放置24、48、120 h 的pH 明顯升高（P＜0.05）；而各時間點之間K+和Na+的檢測結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），并且6 h內(nèi)Cl-和Ca2+含量以及pH值的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 大鼠血清樣本放置不同時間的電解質(zhì)指標(biāo)檢測結(jié)果Table 2 Results of electrolyte indexes of rat serum samples placed for different storage times（ ±s）

表2 大鼠血清樣本放置不同時間的電解質(zhì)指標(biāo)檢測結(jié)果Table 2 Results of electrolyte indexes of rat serum samples placed for different storage times（ ±s）

注：與“0 h”時檢測結(jié)果比較，★P＜0.05。Note：Compared with 0 h，★P＜0.05.

性別Rat sex雄性Male(n=20)雌性Female(n=19)放置時間/h Placement time/h 02462 4 48 120 02462 4 48 120 K+c/(mmol·L-1)5.27±1.97 5.33±2.22 5.31±2.25 5.35±2.25 5.37±2.23 5.35±2.21 5.34±2.16 5.26±1.36 5.23±1.47 5.38±1.43 5.19±1.41 5.29±1.38 5.33±1.43 5.28±1.39 Na+c/(mmol·L-1)142.96±1.09 143.43±1.35 142.93±1.08 142.59±1.22 143.43±1.39 142.57±0.94 142.62±1.23 143.34±0.92 144.29±1.26 143.24±1.09 142.98±1.14 143.88±1.01 142.95±0.92 143.62±1.55 Clc/(mmol·L-1)99.21±1.14 99.81±1.06 99.33±1.37 99.75±1.07 99.42±1.34 100.30±1.47★100.19±1.57★99.66±1.59 99.50±1.58 100.12±1.61 100.19±2.04 99.37±1.84 101.00±1.89★102.23±2.23★Ca2+c/(mmol·L-1)2.24±0.13 2.28±0.07 2.31±0.08 2.32±0.08 2.23±0.16 2.02±0.20★1.87±0.16★2.10±0.18 2.29±0.06 2.34±0.07 2.32±0.08 2.03±0.20 1.86±0.15★1.71±0.09★pH 7.53±0.11 7.44±0.07 7.49±0.10 7.54±0.08 7.65±0.07★7.68±0.08★7.72±0.07★7.61±0.08 7.26±0.10 7.44±0.09 7.50±0.09 7.66±0.08★7.69±0.08★7.76±0.08★

3 討論

電解質(zhì)是人體的重要物質(zhì)，對維持體液滲透壓、體液平衡和酸堿平衡、神經(jīng)和肌肉的應(yīng)激性，以及細(xì)胞正常的物質(zhì)代謝都起到重要的作用，是保證機(jī)體正常代謝和各器官功能正常運行的基本條件［7］。電解質(zhì)主要包括K+、Na+、Ca2+、Mg+、Cl-和HCO3-。實驗動物血液中的電解質(zhì)也是評價動物營養(yǎng)和生理健康狀況的重要指標(biāo)。電解質(zhì)指標(biāo)檢測是一個系統(tǒng)工程，影響因素很多，樣本質(zhì)量的好壞直接影響檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性［8］，其中存儲溫度和放置時間是影響樣本存儲的兩個重要因素。存儲溫度對電解質(zhì)指標(biāo)的影響較小，且可通過冰箱保存降低其影響效果；放置時間就成為檢測過程中比較容易忽略且容易造成電解質(zhì)指標(biāo)檢測結(jié)果誤差的重要因素［5，9-10］。本研究根據(jù)電解質(zhì)指標(biāo)的檢測原理和檢測過程中比較容易出現(xiàn)的延誤時段以及觀察放置時間對檢測結(jié)果影響程度的需要，選擇0 h、2 h、4 h、6 h、24 h、48 h 和120 h 這7 個時間點進(jìn)行研究。

本次研究結(jié)果顯示大鼠血清與人血清樣本放置時間對電解質(zhì)指標(biāo)檢測結(jié)果的影響趨勢相似，但也存在一些差異。實驗動物SD 大鼠的5 個電解質(zhì)指標(biāo)（K+、Na+、Ca2+、Cl-、pH）在放置6 h 內(nèi)檢測結(jié)果與“0 h”的結(jié)果之間沒有明顯差異（P＞0.05）；超過6 h 后K+、Na+檢測結(jié)果與“0 h”比較無明顯差異（P＞0.05），而Ca2+、Cl-和pH 的檢測結(jié)果與“0 h”比較有明顯差異（P＜0.05）。根據(jù)以上檢測數(shù)據(jù)的分析結(jié)果來看，大鼠5 個電解質(zhì)指標(biāo)的檢測樣本應(yīng)盡早檢測，如不能立即檢測，應(yīng)加蓋貯存于2～8 ℃，采血后6 h內(nèi)檢測結(jié)果比較準(zhǔn)確。

綜上，人體電解質(zhì)指標(biāo)在臨床上應(yīng)用已久，對其原理及干擾因素也有了較多的研究，但動物與人的樣本存在著很大的差異，不能簡單地把人體樣本方面的研究成果直接應(yīng)用到動物樣本的檢測中［11-12］。本課題選擇受影響因素較少且動物實驗過程利于采集的大鼠血清樣本進(jìn)行電解質(zhì)檢測研究，通過標(biāo)化麻醉劑、采血管、樣本的種類等各種影響因素［13-16］，選擇容易出現(xiàn)誤差的放置時間進(jìn)行研究，主要比較實驗動物的血清樣本不同放置時間對電解質(zhì)指標(biāo)檢測結(jié)果的影響，為提高動物實驗電解質(zhì)指標(biāo)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性提供了參考依據(jù)。

［醫(yī)學(xué)倫理聲明Medical Ethics Statement］

本研究涉及的所有動物實驗均已通過海南省疾病預(yù)防控制中心實驗動物管理委員會審查批準(zhǔn)（編號：HICDC/CX18-02）。所有實驗操作均在海南省疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行，符合實驗動物相關(guān)法律法規(guī)條例要求。

All of the animal experiments involved in this study have been reviewed and approved by the Experimental Animal Management Committee of Hainan Provincial Center for Disease Control and Prevention （Approval Letter No.HICDC/CX18-02）. All operations were performed in the Hainan Provincial Center for Disease Control and Prevention，following the guidelines such asAnimal Management Regulations（01/03/2017），Laboratory Animal：Guideline for Ethical Review of Animal Welfare（GB/T 35892-2018），ARRIVE 2.0，IGP 2012 and IAVE 2010.

[作者貢獻(xiàn)Author Contribution]

馮丁山為課題的申請人，負(fù)責(zé)動物實驗設(shè)計、質(zhì)量控制、實驗動物觀察、電解質(zhì)指標(biāo)檢測、統(tǒng)計等，為主要貢獻(xiàn)者；黃業(yè)宇、張曉昕、吳愛琴、王湛和蘇林梁根據(jù)課題負(fù)責(zé)人的安排進(jìn)行實驗動物稱重、采血等操作。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。