氣質聯用法測定齊多夫定中甲磺酸甲酯和對甲苯磺酸甲酯

鄭楊楊，唐嘉怡，葉明立，車金水，陳梅蘭*

（1.浙江樹人大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州 310015；2.賽默飛世爾科技（中國）有限公司，上海 201203）

齊多夫定（zidovudine,AZT,1），化學名為1-(3-疊氮-2，3-二脫氧-β-D-呋喃核糖）-5-甲基嘧啶-2，4（1H，3H）-二酮，又名疊氮胸苷，是美國食品及藥物管理局（FDA）批準的第一個抗艾滋病(AIDS)藥物。盡管該藥物有較大的毒副作用，但它與其他藥物聯合應用可延長艾滋病人的生命和減少垂直傳播，在AIDS 藥物使用中仍有比較長的市場壽命[1-2]。

齊多夫定的合成路線很多，主要以胸腺嘧啶脫氧核苷(即胸苷)為原料。文獻報道典型的路線有兩條：（1）以胸苷為原料，與三苯甲基氯反應成醚，保護5 位伯醇羥基，后發生Mitsunobu 反應分子內脫水形成氧化物，在疊氮化鈉的作用下生成疊氮化物，最后脫保護得齊多夫定；（2）以胸苷為原料，依次進行成酯、脫水、疊氮化、脫保護氫反應，最后得到齊多夫定。甲磺酸甲酯與對甲苯磺酸甲酯就是在胸苷與羧酸反應時產生的。

甲磺酸甲酯(methyl methane sulfonate,MMS)是一種能夠損傷DNA 的烷化劑，主要使嘌呤堿基上的氮、氧原子發生甲基化，導致DNA 雙鏈斷裂、點突變[3]。

齊多夫定在生產過程中使用了對甲苯磺酸，反應過程中易生成對甲苯磺酸甲酯，而對甲苯磺酸甲酯的毒性較大。高濃度的對甲苯磺酸甲酯對眼睛、皮膚、粘膜和上呼吸道有強烈刺激作用。還具有強烈的起皰作用，引起手和面部皮疹，多感疼痛、發癢，有時引起手水腫。全身中毒癥狀一般不發生。對皮膚有致敏作用，可引起蕁麻疹。對甲苯磺酸甲酯可燃，具強刺激性，有毒，具致敏性[4]。

由此可見，若齊多夫定中所含甲磺酸甲酯、對甲苯磺酸甲酯的量超出限度，可對人體產生一定危害。因此檢測甲磺酸甲酯、對甲苯磺酸甲酯在齊多夫定中的含量有重要意義。目前檢測甲磺酸甲酯和對甲苯磺酸甲酯的方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣質聯用法等，但大多為單獨檢測，在藥物齊多夫定中對甲磺酸甲酯、對甲苯磺酸甲酯同時檢測未見報道，不便于實際應用[5-8]。

本文采用氣相色譜-質譜法（GC-MS 法）同時檢測甲磺酸甲酯、對甲苯磺酸甲酯在齊多夫定藥物中的含量，可控制藥物生產，提高藥物使用安全性。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 5975-6890N 氣質聯用儀，四級質量分析器，分流/不分流進樣口（美國Agilent 公司）；Agilent DB-5 色譜柱（美國Agilent 公司，30.0 m×250 μm×0.25 μm）；Agilent 不分流襯管（單細徑椎，帶玻璃毛）。

KQ-300GVDV 型臺式三頻恒溫數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，容量13 L，超聲頻率45 kHz、80 kHz、100 kHz 可調，超聲功率300 W，功率在40%～100%之間可調，進水位在1～140 mm 之間）。

甲磺酸甲酯標準溶液和對甲苯磺酸甲酯標準溶液購自中國醫藥集團有限公司。齊多夫定樣品（樣品批號：AT00W110401、AT00W110402、AT00W110403、AT00W110404、AT00W110405）來自臺州某藥廠，甲醇（色譜純）、氦氣（高純）。

1.2 色譜與質譜條件

色譜條件：Agilent DB-5 色譜柱（30.0 m×250 μm×0.25 μm），載氣（99.999%，He）；進樣量1 μL；進樣口溫度為140 ℃，進樣方式為分流（分流比：5:1），載氣流速為1 mL/min；柱溫：初始溫度50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至200 ℃，并保持5 min。

質譜條件：電子轟擊離子源（70 eV）；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；輔助通道溫度為280 ℃；溶劑延遲3 min；甲磺酸甲酯定性特征離子為65、80、95、109 m/z，定量離子為80 m/z[9-10]；對甲苯磺酸甲酯特征離子為65、91、155、186 m/z，定量離子為91 m/z。

1.3 溶液配制

標準儲備液配置：精密稱取甲磺酸甲酯10 mg 置于100 mL 容量瓶中，加入色譜純甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成100 μg/mL 的儲備液。對甲苯磺酸甲酯儲備液配制方法同上，配制好的儲備液置于4 ℃以下冰箱中保存。使用時，用乙酸乙酯稀釋至0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 的溶液。

樣品溶液的配制：將0.1 g 齊多夫定樣品裝入10 mL 容量瓶中，加入甲醇使之溶解，將容量瓶放入超聲振蕩器振蕩30 min，然后用甲醇稀釋至刻度，并在進樣測定之前用0.22 μm 微孔過濾膜過濾處理。

工作曲線溶液配制：以甲醇為溶劑，甲磺酸甲酯、對甲苯磺酸甲酯為溶質配成溶液。

1.4 樣品前處理

精密稱取0.1 g 樣品 (批號：AT00W110401、AT00W110402、AT00W110403、AT00W110404、AT00W110405)于100 mL 容量瓶中，然后再用去離子水溶解，稀釋至刻度。將配制好的齊多夫定溶液20 mL 置于離心管中，再用10 mL 乙酸乙酯提取2 次，于渦旋混合器上混勻2 min，靜止，用尖嘴吸管吸出乙酸乙酯層，合并轉入潔凈的離心管中，氮氣緩流下濃縮至0.5 mL，進樣1 μL，供測定[11-13]。

精密量取空白溶液、供試品溶液及對照品溶液各1 μL，按程序進樣，按外標法計算供試品中甲磺酸甲酯殘留的含量。

2 結果與分析

2.1 色譜柱選擇

色譜柱是色譜類儀器的“心臟”，選擇合適的色譜柱是準確測定目標化合物的保證[14]。為使目標化合物在較短時間內實現良好分離，更準確地測定甲磺酸甲酯和對甲苯磺酸甲酯。對比其他色譜柱，在Agilent DB-5 色譜柱（30.0 m×250 μm×0.25 μm）上甲磺酸甲酯和對甲苯磺酸甲酯的色譜峰比較尖銳對稱，背景噪音低，靈敏度高。

2.2 進樣口溫度選擇

根據隔墊和色譜柱的最高使用溫度以及相關理化性質，在進樣口溫度分別為100 ℃、120 ℃、140 ℃、160 ℃、180 ℃下進行測定。結果發現，溫度在140 ℃下，兩種物質峰面積沒有明顯變化。因此，140 ℃可以滿足這一目標化合物的氣化，故將甲磺酸甲酯、對甲苯磺酸甲酯的進樣口溫度設置為140 ℃。

2.3 柱溫條件選擇

色譜柱溫度是影響分析物分離效果和保留時間的關鍵因素，柱溫的控制方式有恒溫和程序升溫兩種。設置程序升溫時，要綜合考慮峰的分離效果、峰形及峰分析時間，分析時間短、峰形尖銳對稱。實驗最終選用的柱溫條件：初始溫度為50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至200 ℃，并保持5 min。

2.4 方法學考察

分別配制濃度為0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 的甲磺酸甲酯和對甲苯磺酸甲酯兩種標準溶液，在最佳色譜條件下進樣，并進行線性關系、精密度、檢出限和定量限的考察。

精密移取0.1 μg/mL 的甲磺酸甲酯、對甲苯磺酸甲酯溶液各1 μL，分別連續進樣6 針測定峰面積，計算RSD，并以10 倍基線噪聲（S/N=3）計算得到檢出限，標準樣品的線性關系、精密度，結果見表1。

表1 回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限、定量限和重復性

從表1 的測定結果可以看出，該方法的線性關系良好（R2≥0.9993），檢出限為0.2～0.4 μg·mL-1，定量限為0.5～0.8 μg·mL-1，相對標準偏差（RSD）≤6.3%。

2.5 樣品回收率

稱取批號為AT00W110401 樣品進行加標試驗，結果見表2、表3。從表2、表3 可知，甲磺酸甲酯加標回收率在103.75%～118.72%之間，對甲苯磺酸甲酯加標回收率在101.78%～119.61%之間，表明該方法準確度可靠。

表2 甲磺酸甲酯加標回收率和相對標準偏差

表3 對甲苯磺酸甲酯加標回收率和相對標準偏差

加標色譜圖見圖1。

圖1 齊多夫定樣品的加標色譜

2.6 樣品測定

根據上述建立的方法對齊多夫定樣品（批號：AT00W110401、AT00W110402、AT00W110403、AT00W110404、AT00W110405）經前處理后進樣測定，結果未發現5 個批號齊多夫定樣品中有甲磺酸甲酯和對甲苯磺酸甲酯。

3 結論

氣質聯用（GC-MS）法被廣泛應用于復雜組分的分離與鑒定，其具有GC 的高分辨率和質譜的高靈敏度，是生物樣品中藥物與代謝物定性定量的有效工具[15]。由以上檢測結果可知，該齊多夫定藥品中甲磺酸甲酯和對甲苯磺酸甲酯的殘留量未超出標準。樣品的線性范圍大于0.999，加標回收率在103.75%～119.61%之間，重復性試驗的RSD 均小于10%。該方法準確、可靠、靈敏度高,可用于齊多夫定中殘留的痕量甲磺酸甲酯和對甲苯磺酸甲酯的檢測分析。