γ-分泌酶抑制劑在肺纖維化上皮間質轉化中的作用

韓姣，王華兵，徐玲文，董芳

肺纖維化預后極差，嚴重影響患者的生存質量［1-2］。特發性肺纖維化（IPF）是一種嚴重的、發展性的、原因不明的纖維間質性肺炎，多數患者預后不良［1］。目前，間質性肺疾病、肺結核、肺癌放療、肺部寄生蟲感染等均可引起肺纖維化的形成，但是肺纖維化發生、發展的具體機制尚不明確。有研究證實，上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是引起肺纖維化的重要步驟［3］。Notch信號是一條保守的信號轉導途徑，在肺組織早期發育過程中，其家族成員對肺上皮細胞的發育［4-5］、生長及凋亡［6-7］起著重要的調控作用。γ-分泌酶抑制劑（γsecretase inhibitor，DAPT）可間接抑制γ-分泌酶底物Notch的活性，進而影響肺上皮細胞信號傳導和肺上皮細胞分化。Notch信號是形成EMT的重要通路［8］。本實驗旨在探討DAPT能否阻斷、逆轉或部分逆轉轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導的EMT，為肺纖維化相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 肺腺癌上皮細胞株A549購自上海賽百慷公司，在武漢大學典型培養物保藏中心-80℃凍存后保存于液氮罐中；TGF-β1購自美國Pepro Tech公司；DAPT購自美國Selleckchem公司；胎牛血清購自四季青公司；RPMI 1640培養基購自美國Hyclone公司；兔抗人E-鈣黏合素（Ecadherin）、α-肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）購自美國Abcam公司；小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；反轉錄試劑盒購自Thermo Scientific公司；Super Real Pre Mix Plus（SYBR Green）熒光定量試劑盒購自Takara公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；BCA試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養、分組及形態觀察 將A549細胞用完全培養基（含10%胎牛血清、青霉素100 mg/L、鏈霉素100 U/mL的RPMI 1640培養基），置于37℃、5%CO2的培養箱內培養。將等量（1×105/mL）細胞接種于6孔板中，待細胞融合至60%時，再用不含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養24 h。對照組：用RPMI 1640完全培養基培養；TGF-β1組：在含有10μg/L TGF-β1的RPMI 1640培養基中培養；TGF-β1+DAPT組：在含有10μg/L TGF-β1和2μmol DAPT的RPMI 1640培養基中培養；DAPT組：在含有2μmol DAPT的RPMI 1640培養基中培養。每組細胞設置3個復孔，隔天換液，加入干預后48 h于倒置顯微鏡（×400）觀察細胞形態變化。

1.2.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測E-鈣黏合素及α-SMA的mRNA表達 提取上述4組細胞總RNA，并測定RNA濃度。進行qPCR反應，重復3次實驗，取平均值。用Trizol法提取總RNA，按反轉錄試劑盒說明操作合成cDNA。反應條件：42℃60 min，70℃10 min。反應體系（20μL）：RNA反應Mix 12μL，RNA樣品4μL，無酶水4μL。反應結束后將cDNA稀釋10倍，按照SYBR Green熒光定量試劑盒說明操作進行熒光定量PCR檢測。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物，序列見表1。反應體系（20μL）：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.8μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μL，cDNA模板2μL，滅菌水6μL。反應條件：95℃2 min；95℃15 s，60℃30 s，72℃15 s，40個循環。以β-actin為內參，以2－ΔΔCt法計算各基因mRNA相對表達量。

Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 Western blot檢測各組細胞E-鈣黏合素及α-SMA的表達 收集1.2.1各組細胞，使用細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白，按BCA試劑盒操作步驟進行蛋白定量，每個泳道加入50μg蛋白樣品，根據蛋白分子量配制10%的PAGE膠電泳。電泳后將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜（1∶10 000稀釋的E-鈣黏合素、α-SMA，1∶1 000稀釋GAPDH），TBST充分洗滌PVDF膜3～4次，二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，ECL法發光顯影，用Image J軟件將E-鈣黏合素、α-SMA分別與GAPDH灰度值標準化之比作為其蛋白表達的半定量結果。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量數據以±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞形態學結果比較 對照組細胞呈多邊形，鋪路石樣，細胞間連接緊密。與對照組比較，TGF-β1組細胞的形態發生了明顯改變，細胞拉長變成梭形，類似于紡錘體狀且細胞間連接減少。TGFβ1+DAPT組僅有極少數細胞呈梭形，多數細胞形態和對照組相似。而DAPT組形態與對照組大致一致，見圖1。

2.2 各組E-鈣黏合素及α-SMAmRNA表達水平比較 與對照組比較，TGF-β1組E-鈣黏合素mRNA相對表達水平降低，α-SMAmRNA相對表達水平增加（P＜0.05）；TGF-β1+DAPT組和DAPT組E-鈣黏合素及α-SMAmRNA相對表達水平差異無統計學意義。與TGF-β1組比較，TGF-β1+DAPT組E-鈣黏合素mRNA相對表達水平增加，α-SMAmRNA相對表達水平降低（P＜0.05），見表2。

Fig.1 Comparison of cell morphology between the four groups(Bar=20μm)圖1 倒置顯微鏡下各組細胞形態的比較（Bar=20μm）

Tab.2 Comparison of relative expression levels of E-cadherin andα-SMA mRNA between the four groups表2各組細胞E-鈣黏合素和α-SMA mRNA相對表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of relative expression levels of E-cadherin andα-SMA mRNA between the four groups表2各組細胞E-鈣黏合素和α-SMA mRNA相對表達水平比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與TGF-β1組比較，P＜0.05。

組別對照組TGF-β1組TGF-β1+DAPT組DAPT組F E-鈣黏合素0.997±0.149 0.044±0.036a 0.802±0.093b 1.026±0.168b 14.254＊α-SMA 1.045±0.174 1.863±0.095a 1.369±0.149b 1.075±0.065b 26.142＊

2.3 各組E-鈣黏合素及α-SMA蛋白表達水平比較 與對照組比較，TGF-β1組E-鈣黏合素蛋白相對表達水平降低，α-SMA蛋白相對表達水平增加（P＜0.05）；TGF-β1+DAPT組和DAPT組E-鈣黏合素及α-SMA蛋白相對表達水平差異無統計學意義。與TGF-β1組比較，TGF-β1+DAPT組E-鈣黏合素相對表達水平增加，α-SMA蛋白相對表達水平降低（P＜0.05），見圖2、表3。

Fig.2 Western blot assay of E-cadherin andα-SMA圖2 E-鈣黏合素和α-SMA蛋白的Western blot圖

Tab.3 Comparison of proteins of E-cadherin and α-SMA between the four groups表3 各組細胞E-鈣黏合素和α-SMA蛋白相對表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of proteins of E-cadherin and α-SMA between the four groups表3 各組細胞E-鈣黏合素和α-SMA蛋白相對表達水平比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與TGF-β1組比較，P＜0.05。

組別對照組TGF-β1組TGF-β1+DAPT組DAPT組F E-鈣黏合素0.551±0.052 0.286±0.023a 0.497±0.057b 0.590±0.059b 22.121＊α-SMA 0.357±0.037 0.647±0.042a 0.484±0.049ab 0.380±0.040b 29.753＊

3 討論

肌成纖維細胞（MFb）的活化與增生是肺纖維化特征性的病理生理過程，大量的肌纖維母細胞堆積并過分產生細胞外基質是肺纖維化形成和發展的原因［9-10］。在肺纖維化發病過程中，多數病理性的MFb是通過EMT轉分化而來［11-12］。EMT表現為上皮細胞向間質細胞進行轉化，其中上皮細胞標志物E-鈣黏合素表達降低，間質標志物波形蛋白（vimentin）表達升高，而α-SMA作為間質標志物可用于評價EMT［13-14］。TGF-β1可以誘導肺上皮細胞向肺間質細胞轉化［15-16］。本研究結果顯示，與對照組比較，TGF-β1組E-鈣黏合素蛋白和mRNA相對表達水平降低、α-SMA蛋白和mRNA相對表達水平增加，表明TGF-β1處理后可顯著抑制A549細胞中肺上皮細胞標志物E-鈣黏合素mRNA及蛋白表達，而促進肺間質細胞標志物α-SMA mRNA及蛋白的表達。另外，與對照組比較，TGF-β1組細胞的形態發生了明顯改變，細胞拉長變成梭形，類似于紡錘體狀且細胞間連接減少，表明TGF-β1可促使EMT從而導致肺纖維化。

Notch信號通路在肺組織生長發育、細胞分化中起著重要作用［17-18］。有研究顯示，使用Notch信號阻斷劑DAPT干預后，TGF-β1誘導的肺上皮細胞與正常肺上皮細胞無明顯變化，細胞外基質亦無明顯增加，說明Notch信號可促進細胞外基質的分泌［19］。Notch信號通路極有可能作為TGF-β1的一個下游因子參與了其誘導的EMT。本研究結果亦顯示，Notch信號通路經特異性抑制劑DAPT干預后，肺上皮細胞株A549細胞維持典型的鋪路石樣形態，部分逆轉TGF-β1誘導的細胞形態改變，并可促進肺泡上皮細胞標志物E-鈣黏合素mRNA及蛋白的表達，抑制間質細胞標志物α-SMA mRNA和蛋白的表達，再次證實Notch信號通路抑制劑DAPT能夠從基因和蛋白水平阻斷TGF-β1誘導的A549細胞的形態改變、E-鈣黏合素減少、α-SMA增加等變化，即有效逆轉EMT。

綜上所述，Notch信號特異性阻斷劑DAPT很可能是抑制肺泡上皮細胞轉分化為間質細胞的關鍵因素，其可作為一種有效的藥物來抑制EMT，治療肺纖維化或抑制肺纖維化的發生，為臨床治療肺纖維化帶來新的希望。