烤煙蛙眼病病原菌的分離鑒定與生物學特性

潘忠梅，陳興江，孫光軍，何世芳，陸 寧，桑維鈞，曹 毅*

（1貴州省煙草科學研究院，貴州貴陽 550081；2貴州大學煙草學院，貴州貴陽 550025；3中國煙草總公司貴州省公司，貴州貴陽 550004）

0 引言

【研究意義】煙草（L.）為茄科雙子葉植物，是我國重要的經(jīng)濟作物之一。貴州煙草種植歷史悠久，為全國第二大植煙區(qū)（閆新甫等，2021），是煙農(nóng)脫貧的重要支柱產(chǎn)業(yè)。烤煙以收獲葉片為主，葉部類病害嚴重損害其經(jīng)濟效益。煙草蛙眼病主要為害煙草大田時期的成熟葉片，癥狀表現(xiàn)為圓形或不規(guī)則的褐色小斑塊，中心白色，邊緣暗褐色（Shamarao and Hundekar，2010；Zhao et al.，2020），由下部葉向中上部葉蔓延流行（劉愛民和何錄秋，2000）。近年來，煙草蛙眼病在貴州分布范圍和危害有擴大和上升趨勢，病葉采收烘烤后褐色斑點明顯，造成產(chǎn)質(zhì)量下降。因此，明確貴州省烤煙蛙眼病病原菌種類及生物學特性，對病害的有效防治及抗病品種的選育等具有重要意義。【前人研究進展】煙草蛙眼病最早于1893年在美國的北卡羅來納州報道，后在1929年南非和1936年澳大利亞也發(fā)生為害（朱賢朝等，2001）。目前，對煙草蛙眼病的研究僅有少量報道。研究發(fā)現(xiàn)，引起云南、湖南、山東和海南煙草蛙眼病的致病菌為煙草尾孢（）（范靜華和陳海如，1994；何可佳等，1996；Li et al.，2016；Zhao et al.，2020）。范靜華和陳海如（1994）對分離自云南的煙草蛙眼病菌研究結果顯示，病原菌生長最適溫度為27 ℃，致死溫度為63 ℃水浴10 min，最適pH 4～5；而何可佳等（1996）對分離自湖南的煙草蛙眼病菌研究發(fā)現(xiàn)病原菌最適生長溫度為25～30 ℃，致死溫度為55 ℃水浴10 min，pH 5～10生長良好，最適碳氮源為蔗糖和L-天冬酰胺。可見，同種病害不同地區(qū)分離出的病原菌生物學特性存在差異（廖映凱等，2021）。如香蕉棒孢霉葉斑病病原菌與不同寄主作物來源的多主棒孢菌菌株間的生物學特性存在明顯差異（番華彩等，2018）；花椒流膠病病原菌小穴殼菌屬適宜在中性和弱堿性環(huán)境生長（王秀娟等，2019），與高新明（2011）小穴殼菌屬以酸性生長條件較佳的研究結果相反；邵慧慧等（2022）認為，西洋參銹腐病病原菌（）部分研究結果與前人報道存在差異，可能與菌株寄主來源和寄主地理環(huán)境有關。【本研究切入點】目前，貴州省內(nèi)烤煙蛙眼病病原分類地位尚不明確，病原的生物學特性及其與其他省（區(qū)）病菌是否存在差異亦不清楚，缺乏系統(tǒng)性研究。【擬解決的關鍵問題】以采集自貴州煙區(qū)的烤煙蛙眼病病葉為材料，采用常規(guī)組織分離法和離體葉片接種法進行病原菌分離及致病性測定，利用形態(tài)學特征和分子生物學方法對病原菌進行種類鑒定，并對典型菌株進行生物學特性測定，以期為烤煙蛙眼病的綜合防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020年7—10 月，從貴州省銅仁市、安順市西秀區(qū)、安順市普定縣、遵義市、遵義市鳳崗縣、福泉市、黔東南州施秉縣、畢節(jié)市威寧縣、畢節(jié)市大方縣、黔西南州興仁市、貴陽市開陽縣和黔南州翁安縣等12個市（縣）采集具有烤煙蛙眼病典型癥狀的病葉用于病原菌分離。供試烤煙品種：K326。供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（CA）、水瓊脂培養(yǎng)基（WA）、查氏培養(yǎng)基（Czapek）、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基（OA）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）、麥芽提取瓊脂培養(yǎng)基（MEA）、煙葉煎汁培養(yǎng)基（TA1：新鮮煙葉200 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL）和番茄瓊脂培養(yǎng)基（TA2：番茄200 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL）。

1.2 病原菌的分離純化及形態(tài)學鑒定

采用組織分離法對病害樣本進行病原菌分離及純化（方中達，2001）。將表面消毒后的小塊病健交界組織置入PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7 d。用打孔器打取直徑為6 mm的菌餅轉接入PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7 d后，觀察病原菌菌落形態(tài)、顏色、氣生菌絲、分生孢子和分生孢子梗的形態(tài)特征。

1.3 病原菌致病性測定

選取盆栽管理的健康烤煙新鮮葉片，根據(jù)柯赫氏法則，采用離體葉片有傷接種法進行致病性測定（裴月令等，2011），選取致病力較強的菌株進行后續(xù)試驗。

1.4 分子生物學鑒定

1.4.1 病原菌DNA提取 參照試劑盒（DNeasy UltraClean Microbial Kit，Qiagen）說明書提取病原菌DNA。

1.4.2 ITS序列擴增 采用引物ITS4（5'-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3'）/ITS5（5'-GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3'）（上海捷瑞生物工程有限公司合成）對病原菌ITS序列進行PCR擴增。20.0 μL反應體系：PCR Premix 10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA模板2.0 μL，ddHO 7.2 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；95 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.4.3 ITS序列分析 電泳檢測合格的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，序列在NCBI上進行BLAST比對分析，同時將序列提交至GenBank獲取登錄號。下載相似性在99%以上的基因序列，利用MEGA X 的NJ（Neighbor-joining）法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.5 病原菌生物學特性測定

1.5.1 不同培養(yǎng)基對病原菌生長及產(chǎn)孢量的影響采用10種供試培養(yǎng)基，在培養(yǎng)皿中央接種直徑為6 mm的病原菌菌餅，28 ℃培養(yǎng)。

1.5.2 不同溫度、pH和光照條件對病原菌生長及產(chǎn)孢的影響 分別設置5、10、15、20、25、28、30和35 ℃共8個梯度溫度；用1 mol/L的NaOH溶液或1 mol/L的HCl溶液將PDA培養(yǎng)基pH依次調(diào)至5、6、7、8、9、10和11共7個梯度；光照條件設置24 h全光照、24 h全黑暗和12 h光暗交替共3個處理。

1.5.3 不同碳源、氮源對病原菌生長及產(chǎn)孢的影響 以Czapek培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別以蔗糖及等量替換的葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖、果糖、山梨醇和甘露醇為碳源，分別以硝酸鈉及等量替換的丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、尿素、蛋白胨、牛肉浸粉和氯化銨為氮源，配制不同碳源和氮源的培養(yǎng)基，以不加碳源和氮源的培養(yǎng)基為對照，分別將直徑為6 mm的病原菌菌餅放置于培養(yǎng)皿中央，28 ℃培養(yǎng)。

1.5.4 病原菌致死溫度測定 采用6 mm直徑打孔器打取病原菌菌餅，置于預先裝有1 mL無菌水的離心管中，分別于50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和60 ℃恒溫水浴10 min，用無菌牙簽挑取菌餅，置于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d（鄒凱茜等，2020）。每個溫度試驗設3個重復。

1.5.5 數(shù)據(jù)收集與分析 以上不同培養(yǎng)基、溫度、pH、光照條件、碳源和氮源試驗均設3個重復，分別于培養(yǎng)3、5和7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑；培養(yǎng)7 d后，每皿用10 mL無菌水洗滌平板并刮下所有病原菌菌絲體于50 mL離心管中，晃動懸浮液1 min，每皿每次取5 μL懸浮液，共取3次，在光學顯微鏡下鏡檢記錄孢子數(shù)。利用SPSS 26.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 烤煙蛙眼病癥狀

烤煙蛙眼病田間癥狀主要表現(xiàn)為病斑圓形或近圓形，單個，嚴重時幾個病斑連在一起（圖1-A）。病斑邊緣深褐色，中心為白色小點，類似“蛙眼”狀，病斑周邊有淡黃色的暈圈，后期病斑中心可發(fā)生破爛穿孔，空氣潮濕時病斑上長有灰白色霉層（圖1-B）。

圖1 烤煙蛙眼病田間癥狀Fig.1 Symptoms of flue-cured tobacco frog eye disease in field

2.2 烤煙蛙眼病病原菌的分離與致病性測定結果

從采集的病葉樣本中共分離獲得11株菌株，選取具有代表性的分別來源于施秉縣、鳳岡縣和開陽縣的3株菌株YC1110、YC1111、YC1112接種到健康烤煙葉片上，接種6 d后出現(xiàn)典型癥狀（圖2），與田間癥狀一致，對照葉片未見感病癥狀，表明3株菌株為烤煙蛙眼病病原菌。

圖2 分離菌株對烤煙葉片的致病性測定Fig.2 Pathogenicity determination of isolated strains to fluecured tobacco leaves

2.3 烤煙蛙眼病病原菌形態(tài)學鑒定結果

供試病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，菌落呈較規(guī)則圓形，正面粉白，背面米黃；氣生菌絲較少，菌絲匍匐（圖3-A和圖3-B）。在TA2培養(yǎng)基上，菌落圓形，有同心輪紋，背面玫紅色（圖3-C和圖3-D）；在PSA培養(yǎng)基上，菌落圓形，背面中心黑色，邊緣粉紅色，具同心輪紋（圖3-E和圖3-F）。分生孢子梗大小為47.59～227.54 μm×2.27～6.01 μm，個別有分支，呈膝狀彎曲；分生孢子大小為28.11～388.78 μm×1.53～6.24 μm，無分支，呈針狀，基部平切，頂端略尖，無色透明或淡褐色，有隔膜但不明顯（圖4）。

圖3 病原菌在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)Fig.3 Morphology of pathogens on different mediums

圖4 病原菌分生孢子及分生孢子梗形態(tài)Fig.4 Conidia and conidiophore morphology of pathogen

2.4 烤煙蛙眼病病原菌分子鑒定結果

提 取 供 試 菌 株YC1110、YC1111 和YC1112 的DNA，以各菌株的DNA為模板，對ITS序列進行PCR擴增并測序。YC1110、YC1111和YC1112菌株擴增得到的ITS序列長度分別為535、540和547 bp，經(jīng)BLAST比對分析，3株菌株與煙草尾孢（登錄號AF297230）的同源性均達99.8%以上。從系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖5）可看出，3株菌株與煙草尾孢（登錄號AF297230）聚為一支。通過病原菌的致病性測定、形態(tài)學特征結合ITS序列及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，將引起貴州烤煙蛙眼病的病原菌鑒定為煙草尾孢（），序列提交至GenBank后獲取登錄號分別為OK078873、OK078874和OK078875。

圖5 基于YC1110、YC1111和YC1112菌株ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on ITS sequences of YC1110，YC1111 and YC1112 strains

2.5 烤煙蛙眼病病原菌生物學特性測定結果

選取致病力較強的菌株YC1110進行烤煙蛙眼病病原菌生物學特性測定。

2.5.1 不同培養(yǎng)基對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢的影響病原菌在不同培養(yǎng)基上菌落生長速度和產(chǎn)孢量存在明顯差異（表1）。病原菌在供試10種培養(yǎng)基上均能生長，菌落直徑隨著培養(yǎng)時間延長逐漸增大，其中生長至第7 d的最適培養(yǎng)基為CA培養(yǎng)基和TA1培養(yǎng)基，其次為PSA培養(yǎng)基；病原菌在WA培養(yǎng)基上的菌落直徑與OA和MEA培養(yǎng)基差異不顯著（＞0.05），但其菌絲稀疏，生長很差。不同培養(yǎng)基上的病原菌產(chǎn)孢量不同，其中在TA2培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢最多，與在其他培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量差異顯著（＜0.05，下同），其次為TA1和PSA培養(yǎng)基，WA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢最少。

表1 不同培養(yǎng)基對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢的影響Table 1 Effects of different media on growth and spore production of pathogen colony

2.5.2 不同溫度、pH、光照條件對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢的影響 病原菌在10～35 ℃內(nèi)均可生長，5 ℃時不生長，10 ℃時生長極緩慢，最適生長和產(chǎn)孢溫度均為25 ℃，溫度高于28 ℃后菌落生長明顯緩慢，溫度低于20 ℃或高于30 ℃均不利于病原菌生長和產(chǎn)孢（表2）。

表2 不同溫度對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢的影響Table 2 Effects of different temperatures on growth and spore production of pathogen colony

病原菌適宜生長的pH范圍較廣，在pH 5～11內(nèi)均可生長和產(chǎn)孢，pH 7時最適宜病原菌的生長和產(chǎn)孢，其次為pH 6，pH 11時產(chǎn)孢量最少，生長也最慢（表3）。

表3 不同pH對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢的影響Table 3 Effects of different pH on growth and spore production of pathogen colony

不同光照條件影響病原菌菌落生長及產(chǎn)孢。24 h全黑暗條件利于病原菌產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量顯著高于其他2個處理，12 h光暗交替條件下病原菌菌落生長較差且產(chǎn)孢較少（表4）。

表4 不同光照條件對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢的影響Table 4 Effects of different lighting conditions on growth and spore production of pathogen colony

2.5.3 不同碳源、氮源對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢的影響 由表5可看出，病原菌在甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上菌落生長最快，培養(yǎng)7 d后的菌落直徑顯著大于其他處理；其次是可溶性淀粉培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基、山梨醇培養(yǎng)基和蔗糖培養(yǎng)基，麥芽糖培養(yǎng)基上菌落生長最慢。病原菌在不同碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量不同，其中在果糖培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢最多，其次為山梨醇培養(yǎng)基；葡萄糖培養(yǎng)基最不利于病原菌產(chǎn)孢，從其產(chǎn)孢量顯著少于無碳源培養(yǎng)基來看，葡萄糖培養(yǎng)基甚至會抑制病原菌產(chǎn)孢。

表5 不同碳源對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢的影響Table 5 Effects of different carbon sources on growth and spore production of pathogen colony

由表6可看出，病原菌菌落在蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上生長最快，其次為硝酸鈉培養(yǎng)基和牛肉浸粉培養(yǎng)基，病原菌在尿素培養(yǎng)基上不生長；在無氮源培養(yǎng)基上病原菌菌落直徑較大，但菌絲極稀疏，幾乎透明。病原菌在不同氮源培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量不同，其中在牛肉浸粉培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多，其次是蛋白胨培養(yǎng)基，在無氮源和賴氨酸培養(yǎng)基上產(chǎn)孢較少，在尿素培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢。

表6 不同氮源對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢的影響Table 6 Effects of different nitrogen sources on growth and spore production of pathogen colony

2.5.4 病原菌致死溫度測定結果 從圖6可見，50、51、52和53 ℃下水浴10 min處理的菌餅明顯增大，54 ℃及大于54 ℃下水浴10 min處理的菌餅大小無變化，說明菌絲致死溫度為54 ℃水浴10 min。

圖6 病原菌致死溫度測定Fig.6 Determination of lethal temperature of pathogens

3 討論

尾孢類絲孢菌（Cercosporoid hyphomycetes）中最早報道的屬是Fries建立的釘孢屬（Fr.），之后Fresenius建立了尾孢菌屬（Fresen.），在尾孢屬類真菌種的鑒定中采用“同屬的真菌在種的鑒定上以寄主科為范圍”的分類標準（郭英蘭，2020）。尾孢屬真菌是一種重要的植物病原菌（謝學文等，2017），其侵染范圍廣，可侵染多種植物，如煙草（Shamarao and Hundekar，2010）、玉米（劉慶奎等，2013）、綠豆（張海濤等，2016）、梧桐（郭英蘭，2018）、甜瓜（葉云峰等，2018）、藜麥（殷輝等，2019）、花生（Bakhshi and Zare，2020）和甘蔗（高小寧等，2021）等。本研究的3株代表性菌株YC1110、YC1111和YC1112通過形態(tài)學特征觀察、ITS序列及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，將其鑒定為煙草尾孢。形態(tài)學觀察顯示，病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)特征為菌落呈較規(guī)則圓形，正面粉白，反面米黃，氣生菌絲較少，菌絲匍匐，與范靜華和陳海如（1994）的報道相似。病原菌在TA2培養(yǎng)基上菌落背面玫紅色，在PSA培養(yǎng)基上菌落背面粉紅色；菌落兼圓形且具同心輪紋。本研究病原菌分生孢子梗稍大于朱賢朝等（2001）報道的煙草尾孢分生孢子梗35.0～80.0 μm×3.5～5.0 μm；分生孢子小于山東報道的256.0～806.0 μm×4.1～19.5 μm（Li et al.，2016）。表明不同地區(qū)病原菌分生孢子和分生孢子梗大小存在差異。

本研究烤煙蛙眼病病原菌生物學特性測定結果顯示，TA2和TA1培養(yǎng)基最有利于病原菌產(chǎn)孢，與Alasoadura和Fajola（1970）報道煙草尾孢在煙葉煎汁瓊脂培養(yǎng)基上可大量產(chǎn)孢的研究結果相似。Li等（2016）研究結果顯示，煙草尾孢在PDA培養(yǎng)基上無孢子產(chǎn)生，而在燕麥瓊脂培養(yǎng)基中加入煙葉煎汁于黑暗中進行誘孢培養(yǎng)可產(chǎn)孢，表明煙葉可誘導病原菌孢子的產(chǎn)生。TA2和TA1培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量約是PDA培養(yǎng)基上的2倍，CA培養(yǎng)基最有利于病原菌生長。溫度為25 ℃時最適宜病原菌生長與產(chǎn)孢，與黃聲儀等（1994）報道煙草尾孢病害發(fā)展最適溫度為26～30 ℃的研究結論基本一致。烤煙蛙眼病病原菌在pH 5～11內(nèi)均可生長和產(chǎn)孢，pH 7時病原菌生長最快且產(chǎn)孢最多，pH 11時產(chǎn)孢最少，與范靜華和陳海如（1994）報道煙草尾孢最適pH為4～5，pH 10以后的堿性環(huán)境不能生長的研究結果存在差異。烤煙蛙眼病病原菌致死溫度為54 ℃水浴10 min，與何可佳等（1996）報道煙草尾孢致死溫度為55 ℃10 min的研究結果相近，而與范靜華和陳海如（1994）報道煙草尾孢致死溫度為63 ℃10 min的研究結果存在較大差異。24 h全黑暗處理有利于烤煙蛙眼病病原菌產(chǎn)孢，12 h光暗交替處理不利于病原菌的生長與產(chǎn)孢。病原菌菌絲生長最適碳源為甘露醇、最適氮源為蛋白胨；碳源為果糖、氮源為牛肉浸粉時病原菌產(chǎn)孢最多，與何可佳等（1996）報道煙草尾孢最適碳源為蔗糖，病原菌在具L-天冬酞胺的培養(yǎng)基上生長最好的研究結果存在差異。本研究中的尾孢菌分離自貴州煙區(qū)，上述差異的產(chǎn)生可能與生態(tài)環(huán)境有關，表明來自不同寄主尾孢菌或相同寄主不同地區(qū)尾孢菌在生物學特性上存在差異。

4 結論

貴州烤煙蛙眼病病原菌為煙草尾孢（）。煙草尾孢菌絲生長溫度和pH范圍較寬，在TA2和TA1培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多。研究結果為后續(xù)貴州烤煙蛙眼病發(fā)生規(guī)律、抗病鑒定、防治藥劑篩選及綜合防治等研究提供參考。