梭梭HaNAC12轉(zhuǎn)錄因子抗逆功能驗(yàn)證

穆榕博，張 樺，周亮第，劉 豪，姚正培，任燕萍，王 波，馬 麗，楊文艷

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830001）

0 引言

【研究意義】梭梭［（C.A.Mey.）Bunge］藜科（Chenopodiaceae）梭梭屬（）超旱生小喬木，作為我國(guó)西北荒漠區(qū)植被的主要建群種，對(duì)干旱、鹽堿、高溫等極端生態(tài)環(huán)境有著較強(qiáng)的適應(yīng)能力（滿玲娟，2019），不僅具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還是研究植物抗逆分子機(jī)制的理想材料。NAC基因家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，不僅參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，而且在非生物脅迫中發(fā)揮了重要作用（Olsen et al.，2005；周麗霞和曹紅星，2020）。因此，對(duì)梭梭HaNAC12轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行抗逆功能驗(yàn)證，不僅有助于解析梭梭應(yīng)對(duì)逆境因子脅迫分子機(jī)制，還為農(nóng)林作物基因工程提供重要的基因資源，對(duì)梭梭及其他作物遺傳改良具有重要的意義。【前人研究進(jìn)展】NAC轉(zhuǎn)錄因子命名源于矮牽牛（）NAM（No apical meristem）、擬南芥（）ATAF/2和CUC2（Cupshaped cotyledon）（Souer et al.，1996）。該類轉(zhuǎn)錄因子具有共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即N端含有約150個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守NAC結(jié)構(gòu)域，此區(qū)域可結(jié)合DNA和其他蛋白質(zhì)，C端為可變的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域（Ernst et al.，2004）。NAC作為植物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛分布于陸生植物中（李小蘭等，2013），如擬南芥有117個(gè)（Riechmann et al.，2000）、煙草有152個(gè)（Xiong et al.，2005）、水稻有151個(gè)（Pinheiro et al.，2009）NAC家族成員，主要參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過程（李偉等，2011）。Duval等（2002）研究表明，擬南芥AtNAM蛋白在種子胚時(shí)期參與了頂端分生組織的形成。Fang 等（2015）研究表明，水稻基因表達(dá)可增強(qiáng)植株對(duì)干旱、高溫的耐受性。丁澤紅等（2016）通過轉(zhuǎn)錄組水平分析驗(yàn)證木薯NAC家族基因參與了木薯對(duì)干旱的響應(yīng)。Yu等（2016）研究表明，鷹嘴豆基因通過調(diào)控下游逆境相關(guān)基因表達(dá)量從而增強(qiáng)了植株抗旱性。Yang等（2018）研究表明，芒草基因通過調(diào)節(jié)植株對(duì)植物激素ABA的敏感度從而正調(diào)控植株對(duì)干旱和鹽脅迫的響應(yīng)。Chung等（2018）通過Chip-Seq和RNA-Seq分析結(jié)果顯示，水稻中過表達(dá)后通過激活根特異性啟動(dòng)子RCc3改變植株根系結(jié)構(gòu)，從而提高植株的抗旱能力。So和Lee（2019）在擬南芥中過表達(dá)大豆基因可增強(qiáng)了植株耐旱性。Jia等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，蘋果基因通過調(diào)節(jié)光合作用強(qiáng)度來增強(qiáng)抗氧化酶活性，導(dǎo)致植株耐旱性增強(qiáng)。Wang等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，煙草中過表達(dá)明百合花基因后植株耐鹽性上升，但耐旱性下降。陳文燁等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，小麥基因可能參與響應(yīng)高鹽、滲透和冷脅迫等逆境脅迫。本研究課題組基于梭梭干旱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果已克隆差異表 達(dá)NAC 基因，如（李志強(qiáng)等，2016）、（宗興風(fēng)等，2019）、（周亮第等，2021）、（伍霞，2021），并對(duì)其功能進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因均參與植株響應(yīng)非生物脅迫，并提高了植物抵御非生物脅迫的能力。【本研究切入點(diǎn)】雖然已有研究證實(shí)HaNAC12轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥ANAC082和ANAC103親緣關(guān)系更近，同屬于NAC2亞家族（李志強(qiáng)，2016），且該亞族中代表基因（Ohbayashi et al.，2017）與（Yamaguchi et al.，2015）被證明參與了植株對(duì)干旱等非生物脅迫的響應(yīng)，因此，推測(cè)基因同樣參與非生物脅迫響應(yīng)。但目前未見隆基因克隆及功能驗(yàn)證的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因在干旱、高鹽和脫落酸（ABA）處理下的表達(dá)模式分析。利用同源重組法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)噴花法、噴灑除草劑等方法構(gòu)建并篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性株系，在不同脅迫處理后測(cè)定其與野生型（WT）在萌發(fā)率、氣孔開度、相對(duì)含水量、株高、生長(zhǎng)速率和生理指標(biāo)等方面的差異，分析基因在逆境脅迫下的抗逆功能，以期解析梭梭響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制，為梭梭及其他作物抗逆遺傳改良提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料梭梭種子采自新疆古爾班通古特沙漠。擬南芥種子由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室繁存。農(nóng)桿菌菌株GV3101為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。Trazol-up、Fly DNA聚合酶、Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、pEASY Blunt-Zero克隆載體、T4 DNA Ligase和DNA Marker均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒和RNase A購(gòu)于南京諾維贊生物科技有限公司。熒光定量試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于加拿大ABM生物科技有限公司。試驗(yàn)所用卡那霉素、慶大霉素、嗎啉乙磺酸（MES）、乙酰丁香酮、MgCl等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成和DNA測(cè)序均由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。丙二醛、過氧化氫、脯氨酸含量測(cè)定試劑盒和過氧化氫酶測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 篩選顆粒飽滿的梭梭種子，使用100% NaClO溶液渦旋清洗30 s，浸泡5 min，用75%乙醇溶液渦旋清洗30 s，浸泡2 min，用無菌水渦旋浸泡洗滌6次，將梭梭種子移入裝有1/2 MS培養(yǎng)基的組培瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)至梭梭幼苗同化枝長(zhǎng)度約10 cm，25 ℃條件下進(jìn)行模擬干旱處理（20% PEG 6000溶液）、高鹽處理（200 mmol/L NaCl溶液）、（ABA）處理（100 μmol/L ABA溶液）。以正常生長(zhǎng)的植株為對(duì)照。

1.2.2 脅迫下基因表達(dá)分析 使用Primer 5.0設(shè)計(jì)基因的特異性引物（表1），并由生工生物工程有限公司合成。RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法參考Wang（2018）的方法。

1.2.3轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株篩選 根據(jù)基因編碼區(qū)（CDS）設(shè)計(jì)含有I、E II酶切位點(diǎn)引物N12-3301-F/N12-3301-R（表2），用于擴(kuò)增同源重組目的片段。通過同源重組法構(gòu)建pCAMBIA3301-植物表達(dá)載體，利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)噴花法將含有基因完整CDS的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染W(wǎng)T，收種種子記為T代。通過噴灑1/3000除草劑篩選T代轉(zhuǎn)基因擬南芥，并對(duì)存活植株進(jìn)行收種，種子記為T代，使用MS篩選培養(yǎng)基（0.033%除草劑+MS）培養(yǎng)T代轉(zhuǎn)基因植株。使用SPSS 24.0對(duì)其萌發(fā)率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，＞0.05視為符合孟德爾遺傳定律。將符合孟德爾遺傳定律轉(zhuǎn)基因植株移至營(yíng)養(yǎng)土（草炭∶蛭石=2∶1）中培養(yǎng)至收種，種子記為T代；通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR從T代植株中篩選得到3個(gè)表達(dá)量最高的株系記為T代，用于后續(xù)試驗(yàn)，具體操作參考滿玲娟（2021）的方法。

1.2.4轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)率測(cè)定 選用同批收種WT與T代轉(zhuǎn)基因擬南芥作為材料，分別點(diǎn)種54粒在MS培養(yǎng)基、MS+200 mmol/L甘露醇、MS+200 mmol/L NaCl固體培養(yǎng)基中，春化3 d后正常培養(yǎng)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以露白為統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，每隔24 h統(tǒng)計(jì)正常培養(yǎng)基和脅迫培養(yǎng)基中種子萌發(fā)數(shù)目，再根據(jù)種子萌發(fā)率（%）=種子露白數(shù)/種子總數(shù)×100，計(jì)算各株系種子萌發(fā)率。

1.2.5 不同脅迫下表型和生理指標(biāo)測(cè)定 將同批收種WT與T代轉(zhuǎn)基因擬南芥在MS培養(yǎng)基中培育10 d后轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)土中進(jìn)行培養(yǎng)，待培養(yǎng)至4周齡后選擇生長(zhǎng)狀況一致的擬南芥植株分別進(jìn)行干旱脅迫（充分澆足水后進(jìn)行自然干旱）和高鹽脅迫（200 mmol/L NaCl溶液澆灌植株），以正常生長(zhǎng)的植株為對(duì)照。脅迫后分別對(duì)植株表型進(jìn)行拍照記錄并對(duì)比，然后測(cè)量各株系在不同處理下的丙二醛、過氧化氫和脯氨酸含量，以及過氧化氫酶活性。測(cè)定方法參考丙二醛、過氧化氫、脯氨酸含量測(cè)定試劑盒和過氧化氫酶測(cè)定試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.6 氣孔開度和相對(duì)含水量測(cè)定 使用Motic BA400光學(xué)顯微鏡觀察氣孔開度，并使用Motic Image Advanced 3.2進(jìn)行拍照，使用Image J對(duì)氣孔開度進(jìn)行測(cè)量；選取1.2.5中種植的干旱脅迫后的植株，使用軟刷將其從土壤中剝離，分別測(cè)量鮮重、飽和鮮重以及干重，再根據(jù)相對(duì)含水量（%）=（鮮重-干重）/（飽和鮮重-干重）×100，計(jì)算各株系植株的相對(duì)含水量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 24.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），LSD算法對(duì)其顯著性進(jìn)行分析，使用Prism 8.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脅迫處理下梭梭HaNAC12基因表達(dá)分析結(jié)果

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因在模擬干旱（20% PEG 6000）、高鹽（200 mmol/L NaCl溶液）、ABA（100 mmol/L ABA溶液）處理下的表達(dá)情況，結(jié)果如圖1所示。在干旱脅迫下，基因相對(duì)表達(dá)量在處理12 h時(shí)極顯著高于處理0 h（未脅迫）（＜0.01，下同），約為0 h相對(duì)表達(dá)量的4.5倍，于處理24 h時(shí)恢復(fù)至正常水平。高鹽脅迫下，基因相對(duì)表達(dá)量整體呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，處理1 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量極顯著高于處理0 h，而后開始下降。ABA處理下，基因相對(duì)表達(dá)量在處理3和12 h顯著高于處理0 h（＜0.05，下同）。綜上所述，基因能響應(yīng)干旱、鹽和ABA信號(hào)。

2.2 HaNAC12轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株篩選

利用噴灑除草劑對(duì)T代轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行初步篩選，結(jié)果圖2-A所示。將T代收獲的種子記為T代，并重新種植在含有0.033%除草劑的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8 d后對(duì)其成活率進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果符合孟德爾遺傳定律3∶1分離比（圖2-B）。以存活的擬南芥蓮座葉為材料，對(duì)其載體上特異性片段及目的基因特異性片段進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示存活的擬南芥中重組載體均穩(wěn)定表達(dá)（圖2-C）。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥T代，篩選出3 個(gè)高表達(dá)量的株系HaNAC12-1、HaNAC12-2和HaNAC12-3（圖3）。

2.3 HaNAC12轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)率測(cè)定結(jié)果

將WT和不同純合株系轉(zhuǎn)基因擬南芥分別播種在MS培養(yǎng)基、MS+200 mmol/L甘露醇脅迫培養(yǎng)基和MS+200 mmol/L NaCl鹽脅迫培養(yǎng)基上，觀察擬南芥在不同處理下的生長(zhǎng)情況，并定期統(tǒng)計(jì)擬南芥萌發(fā)率，結(jié)果如圖4所示。正常情況下，HaNAC12-1、HaNAC12-2和HaNAC12-3的最終萌發(fā)率分別為86.11%、90.00%和89.44%，與WT（81.11%）無顯著差異（＞0.05）（圖4-A）。200 mmol/L甘露醇模擬的干旱脅迫處理下，WT、HaNAC12-1、HaNAC12-2 和HaNAC12-3的最終萌發(fā)率分別為45.00%、66.11%、80.56%和85.00%（圖4-B）。200 mmol/L NaCl 的鹽 脅 迫處理下，WT、HaNAC12-1、HaNAC12-2和HaNAC12-3的最終萌發(fā)率分別為36.42%、49.38%、51.23%和58.64%，于高鹽脅迫3 d萌發(fā)率出現(xiàn)極顯著差異，并保持極顯著差異至試驗(yàn)結(jié)束（圖4-C）。綜上所述，轉(zhuǎn)基因擬南芥在萌發(fā)期對(duì)干旱和鹽脅迫具有更強(qiáng)的耐受性。

2.4 不同脅迫下HaNAC12轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)情況分析結(jié)果

將正常培養(yǎng)4周齡的轉(zhuǎn)基因擬南芥和WT分別進(jìn)行自然干旱和高鹽脅迫，脅迫后觀察不同脅迫處理下的擬南芥表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)狀態(tài)基本保持一致（圖5-A）；自然干旱15 d后，WT出現(xiàn)明顯的干枯現(xiàn)象，轉(zhuǎn)基因擬南芥各株系出現(xiàn)脫水現(xiàn)象，但未出現(xiàn)干枯（圖5-B）；高鹽脅迫7 d后，WT出現(xiàn)明顯枯黃現(xiàn)象，轉(zhuǎn)基因株系12-1和12-2出現(xiàn)輕微枯黃，轉(zhuǎn)基因株系12-3植株整體仍保持綠色（圖5-C），說明轉(zhuǎn)基因在生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)干旱和鹽脅迫具有更強(qiáng)的耐受性。

此外，在干旱脅迫下3個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系均出現(xiàn)了提前抽薹、早花等生殖發(fā)育加速現(xiàn)象（圖6），分別于脅迫3 、6 和9 d后對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行株高測(cè)量，結(jié)果（圖7-A）顯示，干旱脅迫3 d時(shí)HaNAC12-1、HaNAC12-2和HaNAC12-3株系的平均株高分別為11.3、9.4和10.3 cm，WT的平均株高為0.3 cm；干旱脅迫6 d時(shí)WT出現(xiàn)抽薹現(xiàn)象，平均株高為4.2 cm。基于株高測(cè)量數(shù)據(jù)計(jì)算各株系生長(zhǎng)速率，結(jié)果（圖7-B）顯示，轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫0～3 d時(shí)生長(zhǎng)速率最快，3～9 d時(shí)生長(zhǎng)速率逐漸降低，WT在干旱脅迫0～3 d時(shí)生長(zhǎng)速率接近0，說明在干旱脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因擬南芥生殖生長(zhǎng)速度明顯高于WT。

2.5 干旱脅迫下HaNAC12轉(zhuǎn)基因擬南芥氣孔開度和相對(duì)含水量分析結(jié)果

采集自然干旱脅迫10 d和對(duì)照組（正常澆水培養(yǎng)）擬南芥新鮮蓮座葉下表皮，在顯微鏡下觀察其下表皮氣孔情況（圖8），并測(cè)量其氣孔開度，結(jié)果如圖9-A所示。對(duì)照組中WT、HaNAC12-1、HaNAC12-2和HaNAC12-3的氣孔開度平均值分別為29.14、26.76、28.17和27.74 μm，轉(zhuǎn)基因株系與WT之間無顯著差異。干旱脅迫組中WT、HaNAC12-1、HaNAC12-2和HaNAC12-3的氣孔開度平均值分別為9.46、2.38、4.75和4.15 μm，其中，HaNAC12-1和HaNAC12-3的氣孔開度與WT存在極顯著差異，HaNAC12-2的氣孔開度與WT存在顯著差異。干旱脅迫組WT的氣孔開度比對(duì)照組WT 縮小67.54%，干旱脅迫組HaNAC12-1的氣孔開度比對(duì)照組HaNAC12-1縮小91.08%，干旱脅迫組HaNAC12-2的氣孔開度比對(duì)照組HaNAC12-2縮小83.14%，干旱脅迫組HaNAC12-3的氣孔開度比對(duì)照組HaNAC12-3縮小85.04%。

對(duì)干旱脅迫后對(duì)植株進(jìn)行相對(duì)含水量測(cè)定，結(jié)果（圖9-B）顯示W(wǎng)T相對(duì)含水量為26.19%，HaNAC12-1的相對(duì)含水量顯著高于WT，HaNAC12-2、HaNAC12-3的相對(duì)含水量極顯著高于WT。

2.6 不同脅迫下HaNAC12轉(zhuǎn)基因擬南芥生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.6.1 干旱脅迫對(duì)擬南芥生理指標(biāo)的影響 對(duì)對(duì)照組和干旱脅迫組的植株蓮座葉進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定，并計(jì)算脅迫前后各生理指標(biāo)的變化情況，結(jié)果如圖10所示。對(duì)照組中HaNAC12-1、HaNAC12-2和HaNAC12-3株系的脯氨酸含量與WT無顯著性差異，干旱脅迫組中3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量分別上升1545.53、1401.21和1419.98 μg/g，極顯著高于WT的上升量（607.06 μg/g）（圖10-A）。對(duì)照組中3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的過氧化氫含量與WT無顯著性差異，干旱脅迫組3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的過氧化氫含量分別上升222.59、209.51和162.29 ng/g，極顯著低于WT的上升量（298.92 ng/g）（圖10-B）。丙二醛含量測(cè)定結(jié)果與過氧化氫含量測(cè)定較相似，干旱脅迫組中3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的脅迫前后丙二醛含量變化量極顯著低于WT（圖10-C）。對(duì)照組中3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的過氧化氫酶活性與WT無顯著性差異，干旱脅迫組中3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的過氧化氫酶活性上升318.96、288.12和328.96 U/（g·min），極顯著高于WT的上升量［192.92 U/（g·min）］（圖10-D）。綜上所述，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系具有更強(qiáng)的抗旱性。

2.6.2 鹽脅迫對(duì)擬南芥生理指標(biāo)的影響 對(duì)對(duì)照組和高鹽脅迫組的植株蓮座葉進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定，并計(jì)算脅迫前后各生理指標(biāo)的變化情況，結(jié)果如圖11所示。對(duì)照組中HaNAC12-1、HaNAC12-2和HaNAC12-3株系的脯氨酸含量與WT無顯著性差異，高鹽脅迫組中3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量分別上升1504.97、1271.80和1200.33 μg/g，極顯著高于WT的上升量（640.73 μg/g）（圖11-A）。對(duì)照組中3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的過氧化氫含量與WT無顯著性差異，高鹽脅迫組3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的過氧化氫含量分別上升185.94、181.98和121.73 ng/g，極顯著低于WT的上升量（265.85 ng/g）（圖11-B）。對(duì)照組中3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的丙二醛含量與WT無顯著性差異，高鹽脅迫組3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的丙二醛含量分別上升1.96、2.25和1.80 μmol/g，極顯著低于WT上升量（3.04 μmol/g）（圖11-C）。對(duì)照組中3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的過氧化氫酶活性與WT無顯著性差異，高鹽脅迫組3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的過氧化氫酶活性分別上升254.70、283.54和244.38 U/（g·min），極顯著低于WT的上升量［189.58 U/（g·min）］（圖11-D）。綜上所述，轉(zhuǎn)基因擬南芥具有更強(qiáng)的鹽脅迫抗性。

3 討論

一個(gè)特定的NAC轉(zhuǎn)錄因子往往同時(shí)涉及多個(gè)發(fā)育或應(yīng)對(duì)多個(gè)逆境因子脅迫過程。在過表達(dá)黃麻基因的植株生長(zhǎng)明顯加快，出現(xiàn)了早花現(xiàn)象，并且轉(zhuǎn)基因株系的抗旱性顯著高于WT（Zhang et al.，2021）。擬南芥NAC家族基因被證明不僅參與了植株生長(zhǎng)發(fā)育過程，過表達(dá)后還增加植株對(duì)灰霉菌的抗病性（Wang et al.，2009）。梭梭長(zhǎng)期生活在荒漠、半荒漠環(huán)境，是研究植物抗逆分子機(jī)制的理想材料，對(duì)梭梭NAC轉(zhuǎn)錄因子基因已有報(bào)道，如基因過表達(dá)可增強(qiáng)植株對(duì)干旱、鹽、低溫脅迫抗性（韓聚東，2016）；基因過表達(dá)可增強(qiáng)植株對(duì)干旱、鹽、高溫脅迫抗性（宗興風(fēng)等，2019；伍霞，2021）；過表達(dá)可憎強(qiáng)植株對(duì)高鹽和高溫的耐受性（伍霞，2021），說明梭梭中不同NAC轉(zhuǎn)錄因子在提高植物抗逆性上存在差異。本研究結(jié)果顯示，基因受干旱、鹽和ABA 3種外界脅迫信號(hào)誘導(dǎo)后過表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥株系對(duì)干旱和鹽的抗性較WT明顯增強(qiáng)，且在自然干旱脅迫下蓮座葉下表皮氣孔開度較WT顯著減小，成苗干旱和鹽脅迫后植株脯氨酸含量大幅度升高。根據(jù)脯氨酸的生物學(xué)功能（彭志紅等，2002），推測(cè)基因通過調(diào)節(jié)植物細(xì)胞滲透壓從而增強(qiáng)植株對(duì)干旱和鹽脅迫抗性，結(jié)合熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果和生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果，推測(cè)基因與其同亞族基因作用相近，均通過調(diào)節(jié)植物ABA信號(hào)通路從而增加植株對(duì)于干旱和鹽的抗性（Yamaguchi et al.，2015），其具體的下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需通過進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，HaNAC12轉(zhuǎn)錄因子屬于NAC2亞族（李志強(qiáng)，2016）。擬南芥中NAC2亞族代表基因（和）被證明參與了植株?duì)I養(yǎng)器官生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)（Morishita et al.，2009）；（）通過調(diào)節(jié)植株葉片中的活性氧從而增加植株的抗旱性（Yabuta et al.，2011）。除擬南芥外其他植物中NAC2亞族轉(zhuǎn)錄因子也被證實(shí)與植物非生物脅迫抗性有關(guān)，如剛毛檉柳ThNAC24通過維持細(xì)胞膜完整性增加植株對(duì)

于鹽和干旱脅迫的耐受性（盧惠君等，2019）；辣椒基因?qū)Ω珊得{迫產(chǎn)生響應(yīng)（賴燕，2011）。但目前極少有研究證實(shí)，NAC2亞族基因在受到非生物脅迫后會(huì)增加植株生殖發(fā)育速度，僅大豆（Pimenta et al.，2016）和番茄（Zhang et al.，2021）受到非生物脅迫后植株出現(xiàn)了生殖發(fā)育提前的現(xiàn)象。本研究也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系過表達(dá)基因后在干旱脅迫下出現(xiàn)了生殖發(fā)育提前的生理表型。關(guān)于NAC轉(zhuǎn)錄因子影響植株生殖發(fā)育的研究報(bào)道中，以NAC轉(zhuǎn)錄因子推遲生殖發(fā)育速度的結(jié)論居多，如NTL8（ANAC075）（Fujiwara and Mitsuda，2016）、PwNAC2（Liu et al.，2011）等。因此，今后還需對(duì)基因?qū)χ仓晟嘲l(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)的調(diào)控機(jī)制作深入研究。

4 結(jié)論

擬南芥過表達(dá)基因可增強(qiáng)植株在萌發(fā)期和苗期對(duì)干旱和鹽脅迫的抗性，干旱脅迫后可促進(jìn)擬南芥開花，說明基因可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱和耐鹽性。