一株具有煙草甲毒殺作用的蘇云金芽孢桿菌對(duì)煙葉的影響

胡逸超，蘇 贊，雷 薇，陳義昌，鄒克興，陳 琦*，鄒承武

（1廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，廣西南寧 530001；2南寧國(guó)拓生物科技有限公司，廣西南寧 530001；3廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/植物科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，廣西南寧 530004）

0 引言

【研究意義】未處理的煙葉和成品煙均可能滋生煙草甲（），對(duì)煙草工業(yè)造成較大危害。據(jù)估計(jì)，煙草甲造成的損失占每年煙草總量的0.7%～1.0%（Famham et al.，2007；Edde，2019；夏麗媛等，2020）。目前主要采用熏蒸法防控?zé)煵菁祝朔m然毒殺煙草甲的效果顯著，但越來(lái)越多的研究表明煙草甲具有對(duì)磷化氫的基因遺傳抗性，導(dǎo)致磷化氫使用量不斷提高，引起了行業(yè)對(duì)食品安全的擔(dān)憂，制定了更嚴(yán)格的法規(guī)制約磷化氫使用（齊緒峰等，2006a；呂建華等，2016）。因此，開發(fā)綠色環(huán)保的煙草甲防控技術(shù)成為新的研究熱點(diǎn)。【前人研究進(jìn)展】蘇云金芽孢桿菌（，）在產(chǎn)孢的過程中會(huì)產(chǎn)生伴孢晶體，即殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins），對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目及同翅目等昆蟲有特異性毒殺作用，而對(duì)環(huán)境和非靶標(biāo)生物安全，因此廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的植物保護(hù)領(lǐng)域（Sanchis and Bourguet，2008；崔瑩瑩，2009；Sanahuja et al.，2011；Jouzani et al.，2017；胡逸超等，2020）。煙草甲作為鞘翅目昆蟲，從倉(cāng)儲(chǔ)煙葉中分離對(duì)煙草甲幼蟲具有殺蟲活性的菌株用于生物防治煙草甲，預(yù)示了制劑在防治倉(cāng)儲(chǔ)煙葉害蟲方面有廣闊的應(yīng)用前景（齊緒峰等，2006b）。有研究人員從2652株菌株中篩選出28株菌株產(chǎn)生的伴孢晶體具有毒殺煙草甲的作用，其中致死率最高的菌株毒殺率達(dá)45.3%（Tsuchiya et al.，2002）。胡逸超等（2019）從廣西50份倉(cāng)儲(chǔ)煙葉中篩選獲得1株菌株，其對(duì)煙草甲的毒殺率高達(dá)72.5%。使用產(chǎn)生的芽孢進(jìn)行噴施是較為長(zhǎng)效的防控?zé)煵菁椎姆椒ǎ壳吧袩o(wú)研究表明的使用會(huì)對(duì)人體或動(dòng)物產(chǎn)生危害（Sanahuja et al.，2011）。有研究指出，菌劑應(yīng)用到煙葉上不影響煙葉的化學(xué)成分及評(píng)吸效果，但未見詳細(xì)數(shù)據(jù)報(bào)道（Blanc et al.，2014）。在煙葉中添加微生物除了可用于防控蟲害，還可能加速醇化速度或優(yōu)化煙葉質(zhì)量。Zhao等（2007）研究表明，微生物對(duì)于醇化過程中煙葉的香氣改善和刺激性氣味去除具有重要作用。微生物可通過代謝物和酶的作用促進(jìn)煙葉中生物大分子的轉(zhuǎn)化，從而減少煙堿、亞硝胺等有害成分，增加香味，改善品質(zhì)特性（Maldonado-Robledo et al.，2003；Liu et al.，2015）。微生物菌劑的應(yīng)用不僅會(huì)縮短煙葉發(fā)酵周期，還可改善煙葉香氣（張亞恒等，2015）。芽孢桿菌處理會(huì)降低煙葉中的多種亞硝胺類物質(zhì)（Wei et al.，2014）。由此可見，人為添加微生物可能會(huì)影響煙葉的醇化效果。【本研究切入點(diǎn)】目前，已有使用菌株對(duì)煙草甲進(jìn)行防控的研究（齊緒峰等，2006b），但關(guān)于使用菌株對(duì)煙草各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)及煙葉微生物多樣性的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)1株對(duì)煙草甲具有較強(qiáng)毒殺率的菌株（胡逸超等，2019，2020），擬通過研究該菌株在煙草倉(cāng)庫(kù)中使用是否對(duì)煙葉的各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)和煙葉微生物多樣性造成影響，評(píng)估菌株用于煙草倉(cāng)庫(kù)毒殺煙草甲的應(yīng)用前景。【擬解決的關(guān)鍵問題】對(duì)噴施菌劑并進(jìn)行醇化后的煙葉進(jìn)行化學(xué)成分和評(píng)吸分析，并通過16S rDNA擴(kuò)增子高通量測(cè)序分析煙葉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，以期為煙葉倉(cāng)庫(kù)中應(yīng)用菌劑防控?zé)煵菁椎目尚行院桶踩栽u(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用煙：2018年廣西B3F復(fù)烤煙葉（廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司武鳴倉(cāng)庫(kù)）。試驗(yàn)菌株：從倉(cāng)庫(kù)貯煙中分離的具有煙草甲毒殺作用的蘇云金芽孢桿菌GXZY032（胡逸超等，2019）。

1.2 Bt菌劑制備及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

菌株GXZY032挑取單菌落經(jīng)小體積培養(yǎng)活化后，按照1∶100的比例接種于1000 mL NB培養(yǎng)基中。培養(yǎng)72 h（30 ℃，200 r/min），通過顯微鏡鏡檢計(jì)數(shù)確認(rèn)芽孢含量達(dá)10個(gè)/mL后，離心（8000 r/min，30 min）收集菌體及芽孢，用無(wú)菌水洗滌2次后去除上清，將菌體進(jìn)行冷凍干燥，制成粉劑。按照1 kg煙葉施用0.1 g菌劑的比例，將菌劑均勻噴施到煙葉上。用牛皮紙包裝煙葉，每件煙葉重約100 kg，于2018年4月放置于廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司武鳴廠區(qū)倉(cāng)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行醇化，倉(cāng)庫(kù)溫度維持在6～32 ℃，濕度控制在49%～94%。不施用菌劑的煙葉作為對(duì)照組，施用菌劑的煙葉作為處理組，每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 煙葉化學(xué)成分測(cè)定及感官質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.3.1 樣品采集 煙葉進(jìn)行醇化后，于第12個(gè)月開始，每隔2個(gè)月取樣一次，采用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行取樣，取樣位置至少距離上層煙葉15 cm，每次取樣500 g，共采集7次。

1.3.2 煙葉化學(xué)成分測(cè)定 分別參考YC/T 468—2013《煙草及煙草制品 總植物堿的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》、YC/T 161—2002《煙草及煙草制品 總氮的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》、YC/T 159—2002《煙草及煙草制品 水溶性糖的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》、YC/T 217—2007《煙草及煙草制品 鉀的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》、YC/T 162—2002《煙草及煙草制品 氯的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》和YC/T 216—2013《煙草及煙草制品 淀粉的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》的方法測(cè)定煙葉總植物堿、總氮、總糖、還原糖、鉀、氯和淀粉含量。化學(xué)成分分析使用AutoAnalyzer 3 HR連續(xù)流動(dòng)分析儀（德國(guó)Seal Analytical公司），主要化學(xué)試劑均為分析純。

1.3.3 感官質(zhì)量評(píng)價(jià) 依據(jù)YC/T 530—2015《烤煙 煙葉質(zhì)量風(fēng)格特色感官評(píng)價(jià)方法》的方法，由廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司組織評(píng)吸專家對(duì)煙葉進(jìn)行單體煙評(píng)吸，對(duì)香氣質(zhì)、香氣量、雜氣、刺激性、透發(fā)性、柔細(xì)度、甜度、余味、濃度和勁頭等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)吸人數(shù)及評(píng)吸分?jǐn)?shù)參照楊松等（2018）的方法。

1.4 煙葉細(xì)菌多樣性分析

1.4.1 樣品采集 采集施用菌劑并醇化24個(gè)月后的煙葉作為處理組，以同時(shí)期未施用菌劑的煙葉作為對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4.2 DNA提取 采用多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，參照說明書提取樣品基因組DNA。所得基因組DNA經(jīng)NanoDrop 2000（美國(guó)ThermoFisher公司）檢測(cè)純度，Qubit3.0 Fluorometer熒光計(jì)（美國(guó)ThermoFisher公司）測(cè)定濃度。

1.4.3 16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序 采用引物341F（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）和806R（5'-GGACTA CNNGGGTATCTAAT-3'）擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因的V3～V4區(qū)（Sinclair et al.，2015），所得PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及濃度檢測(cè)，等量混池后使用TruSeq DNA PCR-free Sample Preparation Kit（美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，具體操作步驟參照說明書。所得文庫(kù)使用NovaSeq6000（美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行雙端測(cè)序（Paired-End），雙向各測(cè)250 bp。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用FLASH 1.2.7對(duì)測(cè)序所得reads進(jìn)行拼接（Mago? and Salzberg，2011），Qiime 1.7.0過濾低質(zhì)量tags，以UCHIME Algorithm獲得Effective tags（Edgar et al.，2011），再用Uparse 7.0.1001進(jìn)行聚類（Edgar，2013），相似性達(dá)97%的序列歸為一個(gè)分類單位（Operational taxonomic units，OTU），選取頻率最高的序列作為OTU序列。使用Mothur根據(jù)SILVA中的SSU數(shù)據(jù)庫(kù)（Quast et al.，2013）對(duì)OTUs進(jìn)行各分類水平注釋，利用PyNAST 1.2（Yilmaz et al.，2013）對(duì)OTU序列發(fā)生關(guān)系進(jìn)行計(jì)算，對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理。根據(jù)所有樣品的物種注釋結(jié)果和OTUs豐度信息，將相同分類的OTUs信息合并處理得到物種豐度信息表。使用Qiime 1.7.0計(jì)算各樣品的Alpha多樣性指數(shù)。利用OTUs之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，計(jì)算Unweighted unifrac（Unifrac）距離（Lozupone and Knight，2005），以O(shè)TUs豐度信息對(duì)Unifrac距離進(jìn)一步構(gòu)建Weighted Unifrac距離（Lozupone et al.，2007）。通過多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行主坐標(biāo)分析（Principal co-oridinates analysis，PCoA）。

組間差異顯著性分析采用Student’stest（test）分析，＜0.05視為差異顯著。根據(jù)分析所獲得的數(shù)據(jù)，采用Prism 8.4.0繪制柱狀圖及散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt菌劑處理對(duì)煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響

菌劑處理對(duì)煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響見表1。處理組煙葉的總糖、還原糖、總植物堿和淀粉平均含量高于對(duì)照組，而鉀和總氮平均含量低于對(duì)照組。差異顯著性分析結(jié)果顯示，7種常規(guī)化學(xué)成分在2組之間無(wú)顯著性差異（＞0.05，下同），表明菌劑處理不會(huì)在醇化時(shí)造成煙葉總糖、還原糖、氯、總植物堿、鉀、總氮和淀粉等化學(xué)成分的明顯變化。

2.2 Bt菌劑處理對(duì)煙葉感官質(zhì)量的影響

菌劑處理對(duì)煙葉感官質(zhì)量的影響見圖1。隨著醇化時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和處理組煙葉香氣量（圖1-B）、濃度（圖1-I）和勁頭（圖1-J）的得分表現(xiàn)出一定的降低趨勢(shì)。綜合來(lái)看，處理組煙葉的香氣質(zhì)（圖1-A）、刺激性（圖1-D）、透發(fā)性（圖1-E）、柔細(xì)度（圖1-F）、甜度（圖1-G）、余味（圖1-H）和勁頭的平均評(píng)分稍低于對(duì)照組，其中香氣質(zhì)、透發(fā)性和甜度的平均評(píng)分在處理組和對(duì)照組間存在顯著差異（＜0.05，下同）；處理組煙葉的香氣量、雜氣（圖1-C）和濃度的平均評(píng)分高于對(duì)照組，其中香氣量和雜氣的平均評(píng)分在處理組和對(duì)照組間分別達(dá)顯著和極顯著（＜0.01）差異水平。因此，經(jīng)菌劑處理的煙葉香氣量增加、雜氣減少。評(píng)吸總評(píng)分顯示，對(duì)照組的總評(píng)分為50.46分，處理組的總評(píng)分為49.70分，二者間差異不顯著（=0.5489）。

2.3 Bt菌劑處理對(duì)煙葉細(xì)菌群落的影響

2.3.1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) 基于16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，共得到處理組和對(duì)照組樣品有效片段（Effective tags）665994條，平均長(zhǎng)度為414 bp，聚類分析共得到347條OTU。所有的OTU注釋分類后，共有11門20綱51目90科225屬68種。

圖2顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)菌劑處理后的煙葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。在綱水平上，處理組桿菌綱（Bacilli）的相對(duì)豐度最高（95.9%），其次為甲型變形菌綱（Alphaproteobacteria）（2.8%）；而對(duì)照組的丙型變形菌綱（Gammaproteobacteria）相對(duì)豐度最高（47.6%），甲型變形菌綱（33.7%）次之（圖2-A）。在目水平上，處理組的主要組成有芽孢桿菌目（Bacillales，95.9%）、紅細(xì)菌目（Rhodobacterales，1.2%）和立克次氏體目（Rickettsiales，1.0%）等；對(duì)照組的主要組成有腸桿菌目（Enterobacteriales，31.3%）、立克次氏體目（16.9%）和芽孢桿菌目（Bacillales，15.6%）等（圖2-B）。在科水平上，處理組中相對(duì)豐度前三的分別為芽孢桿菌科（Bacillaceae，96.0%）、紅細(xì)菌科（Rhodobacteraceae，1.2%）和無(wú)形體科（Anaplasmataceae，0.7%）；而對(duì)照組中相對(duì)豐度前三的科分別為腸桿菌科（Enterobacteriaceae，33.7%）、芽孢桿菌科（16.7%）和無(wú)形體科（8.9%）（圖2-C）。在屬水平上，芽孢桿菌屬（，95.9%）、沃爾巴克氏體屬（）（0.7%）和弧菌屬（）（0.4%）等是處理組煙葉中主要的細(xì)菌屬；而志賀氏大腸桿菌屬（）（22.9%）、芽孢桿菌屬（15.5%）和沃爾巴克氏體屬（8.3%）是對(duì)照組煙葉中主要的細(xì)菌屬（圖2-D）。

2.3.2 Alpha和Beta多樣性分析 采用Alpha多樣性分析，比較樣品的細(xì)菌多樣性指數(shù)（表2）。代表群落豐富度的指數(shù)Observed species和Chao1顯示，處理組的細(xì)菌群落豐富度顯著低于對(duì)照組。代表群落多樣性的指數(shù)Shannon和Simpson顯示，處理組的細(xì)菌群落多樣性低于對(duì)照組，但不存在顯著差異。所有樣品的覆蓋度指數(shù)Coverage均為99.9%，說明樣品的測(cè)序結(jié)果合理且具有代表性。

基于主坐標(biāo)分析（PCoA）對(duì)處理組和對(duì)照組煙葉細(xì)菌群落的Beta多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，處理組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)離散程度較對(duì)照組高（圖3-A），2組之間的分離現(xiàn)象明顯，說明2組間的群落結(jié)構(gòu)差異較顯著（圖3-B）。

3 討論

本團(tuán)隊(duì)在前期研究中，獲得1株具有煙草甲毒殺作用的蘇云金芽孢桿菌（胡逸超等，2019）。在煙葉醇化的前期噴施該菌株，可減少倉(cāng)庫(kù)中煙草甲的危害。醇化對(duì)于煙葉的香味具有重要作用，不同的醇化條件會(huì)導(dǎo)致煙葉的致香成分發(fā)生變化，從而影響煙葉的評(píng)吸質(zhì)量（黃靜文等，2010）。已有研究表明，細(xì)菌發(fā)酵的作用會(huì)對(duì)煙葉化學(xué)成分產(chǎn)生影響，不同菌株產(chǎn)生的效果不盡相同（高文霞等，2011；龍章德等，2014）。有研究發(fā)現(xiàn)，微生物的應(yīng)用可能縮短煙葉發(fā)酵周期，改善煙葉香氣（張亞恒等，2015；Liu et al.，2021）。在煙葉的風(fēng)干過程中，添加芽孢桿菌可降低煙葉的有害物質(zhì)亞硝胺含量（Wei et al.，2014）。綜上所述，對(duì)于醇化過程的任何改變，包括添加微生物菌株，均有可能改變煙葉的醇化效果。雖然有研究報(bào)道應(yīng)用到煙葉不影響其化學(xué)成分及評(píng)吸效果（Blanc et al.，2014），同時(shí)本研究所采用的菌株主要目的為防控?zé)煵菁孜：Γ褂迷摼鷦┨幚頍熑~是否會(huì)影響其品質(zhì)尚未知。本研究的主要目的是闡明GXZY032菌株對(duì)煙葉醇化的影響，為后期該菌株的應(yīng)用提供效益或安全方面的評(píng)價(jià)。

本研究結(jié)果表明，在長(zhǎng)達(dá)2年的醇化中，使用蘇云金芽孢桿菌GXZY032未對(duì)煙葉的化學(xué)成分造成顯著影響。在感官質(zhì)量的評(píng)估中發(fā)現(xiàn)，噴施GXZY032后，煙葉香氣量提升、雜氣改善；香氣質(zhì)、透發(fā)性和甜度則表現(xiàn)出一定程度的下降。盡管這5個(gè)感官質(zhì)量評(píng)分在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異，但其平均值差異均小于5%。以往也有研究表明，采用不同方法進(jìn)行煙葉醇化時(shí)，會(huì)造成某一感官指標(biāo)更優(yōu)而另一指標(biāo)評(píng)分降低的現(xiàn)象（Li et al.，2020）。采用蘇云金芽孢桿菌干粉，主要是考慮芽孢在煙草倉(cāng)庫(kù)中能存活的時(shí)間較久，可達(dá)到長(zhǎng)期控制煙草甲的作用。本研究結(jié)果表明，芽孢形態(tài)的菌劑可能在煙葉醇化的過程中對(duì)感官質(zhì)量有一定影響，但影響程度較低。綜上所述，可見菌株GXZY032對(duì)煙葉化學(xué)成分和感官質(zhì)量的影響較小，不會(huì)造成煙葉品質(zhì)的明顯下降，說明在倉(cāng)儲(chǔ)中使用該菌株防控?zé)煵菁子绊憻熑~品質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)較小。

煙葉中常見的細(xì)菌種類較多，主要有芽孢桿菌（）、假單胞菌（Pseudomonas）、鞘脂單孢菌（）、寡養(yǎng)單胞菌（）、歐文氏菌（）、泛菌（）、乳球菌（）、梭菌（）、葡萄球菌（）、腸桿菌（）和類芽孢桿菌（）等（Zhao et al.，2007；Huang et al.，2010；Su et al.，2011；Chopyk et al.，2017；Ye et al.，2017）。Zhou等（2020）研究表明，醇化的煙葉微生物組成中，丙型變形菌綱、腸桿菌目和腸桿菌科含量在各自分類水平上均為豐度最高的物種，屬于最主要的細(xì)菌種類；本研究對(duì)照組中相對(duì)豐度最高的物種在綱、目和科這3個(gè)水平上與Zhou等（2020）的研究結(jié)果一致，說明不同倉(cāng)庫(kù)的醇化煙葉之間，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌存在一定相似性。本研究中，菌株處理后的煙葉細(xì)菌群落Alpha和Beta多樣性指數(shù)均降低，群落結(jié)構(gòu)也較對(duì)照組表現(xiàn)出明顯的差異，表明人為添加菌株改變了煙葉的細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)，與前人研究結(jié)果（Polenogova et al.，2021；Zhang et al.，2021）一致。處理組中相對(duì)豐度最高的OTU為芽孢桿菌且含量高達(dá)95.9%，可能與人為添加菌株會(huì)造成該菌株在煙葉中的定殖，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)菌素，抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)有關(guān)（Cherif et al.，2008）。同時(shí)，菌株處理明顯降低了煙葉腸桿菌目的相對(duì)豐度。腸桿菌目的細(xì)菌作為一種食品污染指示菌，在食品中豐度降低有利于食品安全（Amorim and Nascimento，2017）。然而，也有研究表明，人為添加蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑在食品中會(huì)有殘留，對(duì)于其殘留可能帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)引起了人們對(duì)食品安全的擔(dān)憂（Frederiksen et al.，2006；Johler et al.，2018）。為防控?zé)煵菁锥砑拥奶K云金芽孢桿菌是否會(huì)影響香煙的安全使用，仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

經(jīng)蘇云金芽孢桿菌處理后，煙葉中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，但對(duì)煙葉化學(xué)成分和感官質(zhì)量的影響較小，不造成煙葉品質(zhì)的下降，說明在倉(cāng)儲(chǔ)中使用該菌株防控?zé)煵菁椎慕?jīng)濟(jì)風(fēng)險(xiǎn)較小。