煙草高親和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtHAK5克隆及表達(dá)模式分析

李晨依，喻奇?zhèn)ィ_貞寶，朱紫童，康 俊，賈宏昉*

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南鄭州 450002；2貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，貴州畢節(jié) 551700）

0 引言

【研究意義】煙草（L.）是一種喜鉀經(jīng)濟(jì)作物，其生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)形成與鉀元素密切相關(guān)，但我國(guó)大部分煙葉鉀含量?jī)H1.5%左右（羅華元等，2010），遠(yuǎn)低于優(yōu)質(zhì)煙葉鉀含量的最低標(biāo)準(zhǔn)（2%）（楊鐵釗等，2002）。因此，提高煙葉鉀含量是我國(guó)煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的問題。植物高親和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（High affinity kalium transporter，HAK）屬于K轉(zhuǎn)運(yùn)載體KUP/HAK/KT家族蛋白，該家族成員主要參與低鉀條件下植物對(duì)K的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，還可通過(guò)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)Na/K平衡來(lái)提高植物抗逆性（王北辰和伍國(guó)強(qiáng)，2021）。因此，克隆煙草基因并分析其在不同脅迫下的表達(dá)模式，以期揭示該基因在煙草抵御低鉀脅迫等非生物脅迫中的功能和作用機(jī)制，對(duì)培育K高效吸收優(yōu)質(zhì)煙草新品種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】植物吸收利用K主要是通過(guò)K通道蛋白和K轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)完成（Wang and Wu，2013）。根據(jù)K轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的序列和結(jié)構(gòu)特征，K轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分為四大家族，分別為KUP/HAK/KT家族、HKT/Trk/Ktr家族、CHX家族和KEA家族（He et al.，2012；Song et al.，2019）。其中，KUP/HAK/KT家族最大，成員最多，分布最廣（Ahn et al.，2004）。目前已在大麥（Santa-María et al.，1997）、擬南芥（He et al.，2012）、玉米（Nieves-Cordones et al.，2016）、水稻（Chen et al.，2015）和谷子（Zhang et al.，2018）中鑒定出多個(gè)KUP/HAK/KT家族基因。研究發(fā)現(xiàn)，大麥和基因均受低鉀脅迫誘導(dǎo)表達(dá)量明顯升高，其中過(guò)表達(dá)基因可顯著增加葉片鉀含量（Boscari et al.，2009）；擬南芥基因受低鉀脅迫誘導(dǎo)表達(dá)量明顯升高（Rubio et al.，2014）；水稻中過(guò)表達(dá)基因能顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻K的轉(zhuǎn)運(yùn)效率（Chen et al.，2015），且基因參與調(diào)控K從根部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，在維持水稻Na/K平衡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用（Feng et al.，2019）；谷子基因受低鉀誘導(dǎo)表達(dá)量明顯升高，有效促進(jìn)植株對(duì)K的吸收利用，而基因?qū)Φ外浢{迫不敏感，主要參與正常供鉀條件下K的吸收（Zhang et al.，2018）；玉米的2個(gè)高親和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZmHAK1和ZmHAK5均參與調(diào)控K的轉(zhuǎn)運(yùn)，且ZmHAK5轉(zhuǎn)運(yùn)能力強(qiáng)于ZmHAK1（Qin et al，2019）。有關(guān)煙草基因研究發(fā)現(xiàn)，普通煙草可能有41個(gè)基 因 家 族 成 員，僅 有、、和等少數(shù)基因被克隆鑒定，初步證實(shí)基因不響應(yīng)低鉀脅迫（魯黎明和楊鐵釗，2011），但可通過(guò)協(xié)調(diào)Na/K平衡提高煙株抗逆性（秦利君等，2015；張祎等，2017）；、和基因在煙草幼苗根系中表達(dá)，且在低鉀脅迫下表達(dá)量升高（Song et al.，2019）。【本研究切入點(diǎn)】雖然已證實(shí)家族基因在植物K吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但目前有關(guān)煙草基因的研究報(bào)道較少，尚未見有關(guān)煙草基因克隆及其在不同脅迫下表達(dá)模式分析的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】基于煙草基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，克隆基因，并對(duì)其生物學(xué)信息、亞細(xì)胞定位和表達(dá)模式進(jìn)行分析，進(jìn)而揭示基因在煙草抵御低鉀脅迫及其他非生物脅迫的作用，為探究煙草在非生物脅迫下對(duì)K的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的煙草品種為普通烤煙品種K326。Eastep Super Total RNA Extraction Kit試劑盒購(gòu)自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒、Pro Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒以及大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司。主要儀器設(shè)備：光照培養(yǎng)箱（RXZ-1000，中國(guó)寧波江南儀器廠）、PCR儀（Analytikjena，德國(guó)）、Fluo View FV1000 激光共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）。

1.2 樣品培養(yǎng)及脅迫處理

將煙草種子放入霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液后置于培養(yǎng)箱［光/暗周期為16 h/8 h，溫度為28 ℃/22 ℃，光強(qiáng)度為300 μmol/（m·s），相對(duì)濕度60%］中培養(yǎng)，待種子露白后，先使用1/4霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，再使用1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，最后使用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)4 d后，對(duì)幼苗進(jìn)行非生物脅迫處理（尹卓然等，2022），包括低鉀脅迫處理（0.1 mmol/L K）、干旱脅迫處理（10% PEG-6000）、鹽脅迫處理（150 mmol/L NaCl）、低氮脅迫處理（0.25 mmol/L NO）、低磷脅迫處理（0.1 mmol/L PO）和冷害脅迫處理（4 ℃），以未脅迫處理（正常供鉀2 mmol/L K）的植株樣品為對(duì)照（CK）。其中，冷害脅迫處理3 h后整株取樣，其余脅迫處理7 d后整株取樣，用于檢測(cè)不同脅迫下基因的表達(dá)情況。

用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)煙苗21 d后進(jìn)行低鉀（0.1 mmol/L K）脅迫處理7 d，然后取根、莖、新葉（從上往下數(shù)完全展開的第2片葉）和老葉（從上往下數(shù)第7片葉），用于檢測(cè)基因在煙草不同組織的表達(dá)模式。以正常供鉀（2 mmol/L K）的植株組織為對(duì)照（CK）。

1.3 目的基因克隆

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索獲取基因的參考序列（GenBank登錄號(hào)XM_016628407.1），利用Primer Premier 6設(shè)計(jì)基因編碼區(qū)（CDS）序列的特異擴(kuò)增引物，以低鉀脅迫處理的煙草葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（50 μL）：5×PCR Buffer 10 μL，100 ng/μL cDNA 模 板2 μL，Primer Star DNA聚合酶1 μL，10 μmol/L上、下游引物2 μL；2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，ddHO補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃5 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃2.5 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。利用DNA連接酶將擴(kuò)增獲得的目的片段和pMD19-T載體連接，送武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，從而獲得目的基因序列信息。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的ORFfinder將基因序列翻譯成氨基酸序列；利用NetPhos 2.0 Serve預(yù)測(cè)NtHAK5的磷酸化位點(diǎn)；利用DNAMAN 9.0將NtHAK5蛋白與煙草、擬南芥、玉米和水稻的HAK家族蛋白進(jìn)行氨基酸序列分析；利用ExPASy網(wǎng)站的ProtParam和SWISS-MODEL分析蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)；使用TMPRED預(yù)測(cè)NtHAK5蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域（黃化剛等，2016）。

1.5 啟動(dòng)子順式作用元件分析

以基因CDS序列作為探針，利用Sol Genomics Network中的Blast程序查詢?cè)摶蛐蛄腥L(zhǎng)，并利用PlantCARE網(wǎng)站對(duì)其起始密碼子上游2000 bp序列進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析（曾露桂等，2020）。

1.6 亞細(xì)胞定位分析

參考尹卓然等（2022）的方法構(gòu)建植物表達(dá)載體pBWA（V）HS--GLosgfp，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染煙草表皮細(xì)胞，然后置于培養(yǎng)箱（溫度22 ℃）中培養(yǎng)30～60 h。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中熒光蛋白的位置。以不含基因序列的pBWA（V）HS-GLosgfp空載體為對(duì)照。

1.7 基因表達(dá)分析

參照Pro Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)，選擇煙草核糖體蛋白編碼基因（）（GenBank登錄號(hào)L18908.1）作為內(nèi)參基因，設(shè)3次重復(fù)。采用2算法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量（黃化剛等，2016），并利用DPS7.0和Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtHAK5基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以普通煙草K326的葉片cDNA作為模板擴(kuò)增基因全長(zhǎng)CDS序列，結(jié)果（圖1）顯示，擴(kuò)增條帶長(zhǎng)度約為2500 bp。將其測(cè)序結(jié)果與基因參考序列（XM_016628407.1）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，兩者的核苷酸序列相似性達(dá)100%，表明克隆獲得的序列為基因CDS序列，長(zhǎng)度為2418 bp，編碼805個(gè)氨基酸殘基。

2.2 NtHAK5蛋白的理化性性質(zhì)及結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果

NtHAK5蛋白由805個(gè)氨基酸組成，分子式為CHNOS，分子量為89874.00 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為8.65，含有70個(gè)酸性氨基酸和77個(gè)堿性氨基酸；不穩(wěn)定性指數(shù)（Ⅱ）為33.70，屬于穩(wěn)定蛋白。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占40.12%，延伸鏈占24.97%，無(wú)規(guī)則卷曲占26.21%，β-折疊占8.70%。NtHAK5蛋白包含45個(gè)絲氨酸、19個(gè)蘇氨酸和11個(gè)酪氨酸，推測(cè)磷酸化可能發(fā)生在以上位點(diǎn)，且其包含12個(gè)疏水跨膜區(qū)，第二和第三區(qū)域間存在1個(gè)帶電荷中央親水環(huán)，并將其分成2組，具有典型的植物HAK家族跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2）。

2.3 NtHAK5蛋白的氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

NtHAK5與煙草NtHAK1和黃花煙草NrHAK1蛋白的氨基酸相似性分別為40.69%和40.44%，與擬南芥AtHAK5、玉米ZmHAK5和水稻OsHAK1蛋白的氨基酸相似性為58.26%、56.24%和52.47%（圖3）。根據(jù)氨基酸序列的相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖4）顯示NtHAK5蛋白與AtHAK5蛋白聚在一個(gè)分支，推測(cè)煙草NtHAK5蛋白具有與擬南芥AtHAK5蛋白相似的功能，故推測(cè)NtHAK5蛋白介導(dǎo)高親和性K吸收并參與調(diào)控?zé)煵軰轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。

2.4 NtHAK5基因啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果

由圖5可知，在基因啟動(dòng)子中包含2個(gè)參與厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)的順式作用元件（ARE）；2個(gè)與脫落酸（ABA）響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件（ABRE），其能與轉(zhuǎn)錄因子有效結(jié)合，從而促進(jìn)或抑制ABA誘導(dǎo)基因的表達(dá)，致使植株衰老速度加快或減緩；1個(gè)參與低溫響應(yīng)的順式作用元件（LTR），1個(gè)參與干旱響應(yīng)的順式作用元件（MBS），可分別增強(qiáng)植物的抗寒和抗干旱能力；1個(gè)參與防御和應(yīng)激響應(yīng)的順式作用元件（TC-rich repeats）；2個(gè)參與茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)的順式作用元件（CGTCA-motif和TGACG-motif），其能響應(yīng)植物損傷，外源使用MeJA可誘導(dǎo)防御基因表達(dá)，從而激發(fā)植物的化學(xué)防御，推測(cè)基因在逆境脅迫響應(yīng)和延緩植物衰老過(guò)程中發(fā)揮作用。

2.5 NtHAK5蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果

將構(gòu)建的植物表達(dá)載體pBWA（V）HS--GLosgfp通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染煙草表皮細(xì)胞后，利用熒光共聚焦顯微鏡觀察侵染后的葉片，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)葉片細(xì)胞的細(xì)胞膜中有熒光信號(hào)，表明NtHAK5蛋白定位于煙草葉片的細(xì)胞膜上。

2.6 低鉀脅迫下NtHAK5基因的組織表達(dá)特性分析

利用qRT-PCR檢測(cè)低鉀脅迫處理（0.1 mmol/L K）下不同組織基因的相對(duì)表達(dá)量，以正常供鉀（2 mmol/L K）的植株組織為對(duì)照（CK），結(jié)果如圖7所示。低鉀脅迫處理下和正常供鉀（CK）條件下，基因在煙草根、莖、老葉和新葉中均有表達(dá)，且均以老葉中相對(duì)表達(dá)量最高，表明基因主要在葉片尤其是老葉中高表達(dá)，具有明顯組織表達(dá)特異性。在低鉀脅迫處理下，煙草根、莖、老葉和新葉中基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于CK（＜0.05，下同），說(shuō)明基因受低鉀脅迫誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)，可能參與煙草抵御低鉀脅迫的過(guò)程，屬于典型的家族基因，不僅參與K的吸收，還參與了煙草葉片中K再利用過(guò)程。

2.7 非生物脅迫下NtHAK5基因的表達(dá)特性分析

為了研究基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)，以無(wú)脅迫處理（正常供鉀2 mmol/L K）的植株為對(duì)照（CK），通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)不同非生物脅迫下的基因的表達(dá)情況，結(jié)果如圖8所示，基因在干旱脅迫、冷害脅迫、鹽脅迫和低鉀脅迫下的相對(duì)表達(dá)量顯著高于CK，但在低氮脅迫和低磷脅迫下的相對(duì)表達(dá)量與CK無(wú)顯著差異（＞0.05），說(shuō)明基因參與煙草植株對(duì)干旱脅迫、冷害脅迫、鹽脅迫和低鉀脅迫的響應(yīng)。

3 討論

家族基因已在多種植物中被克隆和鑒定，其主要參與植物對(duì)K的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)與再利用，且大部分基因受低鉀脅迫信號(hào)的調(diào)控（蘇文等，2020）。本研究對(duì)基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明基因編碼蛋白共有12個(gè)疏水跨膜區(qū)，第二和第三區(qū)域間存在1個(gè)帶電荷中央親水環(huán)，與已報(bào)道的HAK蛋白結(jié)構(gòu)高度相似（Véry and Sentenac，2003），證明NtHAK5蛋白具有HAK家族成員特征。氨基酸序列對(duì)比結(jié)果顯示，NtHAK5蛋白與擬南芥AtHAK5蛋白的氨基酸序列相似性最高。將NtHAK5與其他植物的HAK蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明NtHAK5與擬南芥AtHAK5聚在一個(gè)分支，證明兩者親緣關(guān)系最近，基因具有基因相似的生物學(xué)功能。由于AtHAK5是擬南芥中重要的高親和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ahn et al.，2004），故推測(cè)NtHAK5蛋白在煙草K吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。啟動(dòng)子的順式作用元件能調(diào)控基因的表達(dá)模式（Saeed et al.，2006），且與多種脅迫響應(yīng)密切相關(guān)（Walther et al.，2007）。本研究發(fā)現(xiàn)基因啟動(dòng)子不僅包含多個(gè)參與防御、低溫響應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)和干旱誘導(dǎo)等順式作用元件，還含有響應(yīng)ABA誘導(dǎo)的核心元件ABRE，由于ABA在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用（張彥桃等，2014），因此，推測(cè)受ABA信號(hào)的調(diào)控參與各種非生物脅迫。本研究亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，NtHAK5蛋白主要定位于細(xì)胞膜，與其他植物HAK家族蛋白的亞細(xì)胞定位一致，如水稻中的OsHAK1、OsHAK2和OsHAK5蛋白定位于細(xì)胞膜（柴薇薇等，2019）。由于植物蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位結(jié)果暗示其功能特性，故推測(cè)NtHAK5蛋白通過(guò)細(xì)胞膜參與煙草植株的K吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)。綜上所述，初步推測(cè)NtHAK5是具有吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)K功能的膜蛋白，并參與多種非生物脅迫過(guò)程。

本研究對(duì)基因在煙草不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因在根、莖和葉中均有表達(dá)，尤其在老葉中相對(duì)表達(dá)量最高，可能該基因通過(guò)調(diào)控老葉中K的再利用參與煙草生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，表明基因具有組織特異性。本研究進(jìn)一步分析了基因在煙草非生物脅迫下的表達(dá)模式，并結(jié)合啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果，推測(cè)基因參與了非生物逆境脅迫（低鉀、干旱、高鹽和冷害）下K的吸收和再利用過(guò)程，尤其是通過(guò)調(diào)控老葉中K的再利用從而提高煙草的鉀素利用效率。轉(zhuǎn)錄調(diào)控在植物體內(nèi)普遍存在，主要用于響應(yīng)外界環(huán)境刺激。目前已有大量研究證明，K轉(zhuǎn)運(yùn)體基因主要在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)節(jié)，如擬南芥中的轉(zhuǎn)錄因子ARF2和RAP2.11可直接結(jié)合到基因啟動(dòng)子上，從而調(diào)節(jié)該基因轉(zhuǎn)錄水平，區(qū)別在于ARF2是基因的負(fù)向調(diào)控因子，并在低鉀條件下發(fā)生磷酸化，從而解除對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄抑制（趙帥，2016），而RAP2.11正向調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而響應(yīng)低鉀脅迫（王欣等，2013）。此外，植物響應(yīng)低鉀脅迫還受Ca、活性氧（ROS）和茉莉酸等信號(hào)物質(zhì)的影響，推測(cè)低鉀脅迫下基因表達(dá)可能受以上或其他轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)物質(zhì)調(diào)控，且調(diào)控機(jī)制尚待研究。目前擬南芥、水稻等模式植物中多個(gè)基因已被證實(shí)可響應(yīng)低鉀脅迫、高鹽脅迫和干旱脅迫等，例如、和基因在鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)，通過(guò)維持水稻中的Na/K平衡從而增強(qiáng)水稻的耐鹽性（Yang et al.，2014；Chen et al.，2015；Shen et al.，2015）；擬南芥、和基因參與調(diào)控?cái)M南芥的耐鹽反應(yīng)（Aleman et al.，2014）；擬南芥基因通過(guò)正向調(diào)節(jié)鉀含量促進(jìn)植物響應(yīng)干旱和滲透脅迫（Brauer et al.，2016）；在煙草中過(guò)表達(dá)基因可提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性等（張祎等，2017）。因此，今后可通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)深入解析基因在煙草K吸收與再利用過(guò)程中的生物學(xué)功能。

4 結(jié)論

屬于基因家族成員，具有明顯組織表達(dá)特異性，參與煙草植株對(duì)干旱脅迫、冷害脅迫、鹽脅迫和低鉀脅迫等非生物脅迫響應(yīng)，推測(cè)其編碼的蛋白在煙草組織中作為K轉(zhuǎn)運(yùn)體參與非生物脅迫下K的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和再利用。