兒童急性B淋巴細胞白血病誘導治療第8天外周血微小殘留病的臨床意義

魏圣潔, 竇留瑞, 劉 煒, 時明月, 肖夢宇, 李 丹, 牛曉娜, 牛俊偉, 白炎亮, 孫 愷

(1. 鄭州大學人民醫院, 河南 鄭州, 450003; 2. 河南省兒童醫院 血液腫瘤科, 河南 鄭州, 450000;3. 河南省人民醫院 血液科, 河南 鄭州, 450003)

急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)是兒童最常見的血液系統惡性疾病，具有高度異質性。隨著預后危險度分層和治療策略的不斷完善, B-ALL患兒5年生存率高達90%, 而緩解后復發仍是治療失敗的根本原因[1]。微小殘留病(MRD)是指白血病治療后體內殘存白血病細胞低于常規形態學檢測閾值的狀態，常用的檢測方法包括流式細胞術(FCM)、實時定量聚合酶鏈反應(RQ-PCR)和二代測序(NGS)技術[2]。國內外多項研究[3-4]顯示, MRD陽性是導致復發的關鍵因素，在B-ALL患兒預后評估、復發預測、風險分層及個體化治療指導中具有重要作用。目前，臨床大多通過有創性操作方式骨髓穿刺抽取新鮮骨髓液進行MRD檢測，但檢測時機尚不完全統一。美國癌癥綜合網(NCCN)指南[5]已明確將誘導治療第8天外周血MRD作為調整兒童B-ALL危險度分層的依據，而中國關于早期外周血MRD檢測在B-ALL患兒危險度分層及預后中應用效果的研究尚較缺乏。本研究基于美國國家癌癥研究所(NCI)支持的TARGET公共數據庫[6]探討誘導治療第8天外周血MRD檢測在B-ALL患兒預后評估中的意義，現報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取TARGET數據庫(https://ocg.cancer.gov/)中2000—2010年初診的359例B-ALL患兒作為研究對象?；純壕汧CM檢測誘導治療第8天外周血MRD和誘導治療第29天骨髓液MRD，敏感度為0.01%。納入標準: ① 年齡1～18歲者; ② 符合B-ALL診斷標準[5]者; ③ 誘導治療第8天外周血MRD和第29天骨髓MRD均檢測者。排除標準: ① 臨床資料不完整者; ② 合并其他惡性腫瘤者。

1.2 治療方法

所有患兒接受B-ALL標準方案治療，即美國兒童腫瘤協作組(COG)治療方案(AALL0331、AALL0232和P9906)[5], 均采用甲氨蝶呤、阿糖胞苷、地塞米松鞘內注射以預防中樞神經系統白血病，其中誘導治療方案以VDLP方案為基礎，包括長春新堿、柔紅霉素、左旋門冬酰胺酶、糖皮質激素。

1.3 療效評估及隨訪

數據庫隨訪截止日期為2022年1月26日，平均隨訪時間為8(4, 9)年，分析5年無事件生存(EFS)率，療效評估標準參照文獻[5, 7]。完全緩解(CR): ① 骨髓原始淋巴細胞<5%; ② 外周血中性粒細胞計數>1.0×109/L, 血小板計數>100×109/L, 無原始淋巴細胞; ③ 無髓外白血病。復發: CR后重新出現骨髓原始淋巴細胞>5%, 或外周血出現原始淋巴細胞，或出現白血病髓外侵犯。EFS時間: 自確診日期至誘導治療失敗、復發、死亡或末次隨訪日期的時間。

1.4 統計學方法

分別采用SPSS 23.0、GraphPad Prism 8.0.1軟件對入組患兒臨床資料進行統計學分析、繪圖。非正態分布的計量資料以[M(P25,P75)]表示，計數資料以[n(%)]表示。相關性分析采用Spearman相關分析法; 采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，以Log-rank檢驗分析EFS率的組間差異; 采用Cox單因素及多因素回歸分析探討預后的危險因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床特征分析

359例B-ALL患兒中，男219例，女140例，男女比例為1.6∶1, 平均年齡10.1(3.9, 14.3)歲;TCF3-PBX1基因陽性38例,ETV6-RUNX1基因陽性35例, 4號和10號染色體三倍體陽性35例,MLL基因重排陽性22例,BCR-ABL1基因陽性6例; 初診時平均白細胞計數為24.8(8.0, 112.0)×109/L, 平均DNA指數為1.0(1.0, 1.1); 第8天骨髓原始細胞占比為10.0(2.0, 40.0)%, 第29天骨髓原始細胞占比為0(0, 1.0)%, 第8天外周血MRD為0.5(0.1, 2.3)%, 第29天骨髓MRD為0(0, 0.1)%。見表1。至數據庫隨訪截止日期，未發生事件者223例，發生事件者136例(誘導治療失敗3例，死亡9例，復發124例)，總體5年EFS率為(62.2±2.6)%。

表1 359例B-ALL患兒的臨床特征分析

2.2 第8天外周血MRD與第8天骨髓細胞形態學的相關性

Spearman相關分析顯示，誘導治療第8天外周血MRD水平與第8天骨髓原始細胞占比呈正相關(r=0.620,P<0.001)。

2.3 第8天外周血MRD、第29天骨髓MRD水平對B-ALL患兒5年EFS率的影響

誘導治療第8天，外周血MRD<0.01%、0.01%～<0.10%、0.10%～<1.00%、≥1.00%的B-ALL患兒分別為45、65、114、135例, 5年EFS率分別為(76.9±6.4)%、(81.2±4.9)%、(59.8±4.7)%、(49.9±4.4)%, 不同外周血MRD水平患兒的5年EFS率比較，差異有統計學意義(P<0.001)。第8天外周血MRD 0.10%～<1.00%、≥1.00%患兒的生存曲線大幅下降，提示第8天外周血MRD≥0.10%是B-ALL患兒5年EFS率低的高危因素。見圖1。

圖1 誘導治療第8天不同外周血MRD水平B-ALL患兒的生存曲線

誘導治療第29天，骨髓MRD<0.01%、0.01%～<0.10%、0.10%～<1.00%、≥1.00%的B-ALL患兒分別為227、47、54、31例，5年EFS率分別為(74.4±3.0)%、(45.4±7.4)%、(48.8±6.9)%、(20.2±7.8)%, 不同骨髓MRD水平患兒的5年EFS率比較，差異有統計學意義(P<0.001)。第29天骨髓MRD 0.01%～<0.10%、0.10%～<1.00%、≥1.00%患兒的生存曲線大幅下降，提示第29天骨髓MRD≥0.01%是B-ALL患兒5年EFS率低的高危因素。見圖2。

圖2 誘導治療第29天不同骨髓MRD水平B-ALL患兒的生存曲線

2.4 第8天外周血MRD聯合第29天骨髓MRD檢測結果與5年EFS率的關系

以第8天外周血MRD≥0.10%、第29天骨髓MRD≥0.01%為界值，將359例B-ALL患兒分為雙陰性組90例、單陽性組157例和雙陽性組112例, 5年EFS率分別為(84.0±3.9)%、(66.8±3.9)%和(38.0±4.7)%, 差異有統計學意義(P<0.001)。見圖3。

圖3 第8天外周血MRD與第29天骨髓MRD聯合檢測不同結果患兒的生存曲線

第29天骨髓MRD陰性患兒中，第8天外周血MRD陰性者(骨髓MRD陰性外周血MRD陰性組)90例、第8天外周血MRD陽性者(骨髓MRD陰性外周血MRD陽性組)137例, 5年EFS率分別為(84.0±3.9)%、(67.9±4.1)%, 差異有統計學意義(P=0.009)。見圖4。

圖4 第29天骨髓MRD陰性患兒第8天外周血MRD陽性、陰性者的生存曲線

第29天骨髓MRD陽性患兒中，第8天外周血MRD陰性者(骨髓MRD陽性外周血MRD陰性組)20例、第8天外周血MRD陽性者(骨髓MRD陽性外周血MRD陽性組)112例, 5年EFS率分別為(59.2±11.1)%、(38.0±4.7)%, 差異無統計學意義(P=0.095)。見圖5。

圖5 第29天骨髓MRD陽性患兒第8天外周血MRD陽性、陰性者的生存曲線

2.5 B-ALL患兒EFS的危險因素

單因素Cox回歸分析結果顯示，初診白細胞計數≥50×109/L、DNA指數<1.16、ETV6-RUNX1基因陰性、4號和10號染色體三倍體陰性、第8天骨髓原始細胞占比≥20%、第29天骨髓原始細胞占比≥5%、第8天外周血MRD≥0.10%和第29天骨髓MRD≥0.01%是B-ALL患兒EFS的危險因素(P<0.05); 將上述變量進一步納入多因素Cox回歸分析，結果顯示DNA指數<1.16、第29天骨髓原始細胞占比≥5%、第8天外周血MRD≥0.10%、第29天骨髓MRD≥0.01%是B-ALL患兒EFS的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

3 討 論

B-ALL是一種源自造血干細胞/祖細胞的惡性增殖性血液系統腫瘤，具有顯著個體化差異?，F有指南[5, 7-8]已明確提出多種因素與B-ALL患兒預后相關，如初診時年齡、外周血白細胞計數、細胞遺傳學特征、早期治療反應、治療過程中骨髓緩解狀態和MRD水平等。BOROWITZ M J等[9-10]研究指出，兒童B-ALL細胞遺傳學預后取決于MRD狀態, MRD是患兒預后不良的獨立危險因素。近期有學者[11]基于TARGET數據庫建立兒童B-ALL預后列線圖，再次證實MRD水平在兒童B-ALL預后評估中具有重要價值。

目前，臨床研究大多建議首選骨髓標本作為MRD檢測標本。早期國外研究[12]顯示，外周血MRD和骨髓MRD在急性T淋巴細胞白血病預后評估中具有較好一致性，但在B-ALL中一致性較差。一項前體B-ALL研究[13]發現，外周血MRD預測復發的敏感度較骨髓MRD更高，這可能是由于前體B細胞來源于骨髓，外周血MRD陽性更能提示疾病復發。葛麗衛等[14]亦發現，以骨髓形態學復發為金標準，外周血MRD水平在急性白血病患者復發率評估中具有較好的敏感性。本研究結果顯示，誘導治療第8天外周血MRD水平在B-ALL患兒預后評估中具有重要意義，隨著第8天外周血MRD水平的升高，患兒5年EFS率降低。本研究還發現，第8天外周血MRD水平與第8天骨髓原始細胞占比具有強正相關性; 單因素Cox回歸分析顯示，第8天外周血MRD≥0.10%和第8天骨髓原始細胞占比≥20%均提示EFS差; 多因素Cox回歸分析顯示，第8天外周血MRD≥0.10%是EFS的獨立危險因素。由此提示，外周血MRD可作為B-ALL患兒較為可靠的預后指標，是骨髓細胞形態學的有益補充。此外，從創傷性角度分析，由于白血病的異質性, MRD檢測結果僅能反映穿刺部位骨髓情況，有時需多部位取材，這在一定程度上加重了患兒的痛苦，而外周血MRD檢測操作簡便且創傷性小，可提高患兒就醫依從性[15]。

第8天潑尼松試驗結果是早期治療反應的重要觀察指標，采用外周血細胞形態學方法進行評估，靈敏度相對較低。本研究采用FCM檢測誘導治療第8天外周血MRD，敏感度為0.01%, 優于潑尼松試驗。近期多項研究[16-18]顯示，與FCM、RQ-PCR等方法相比，敏感度更高的檢測方法如NGS可更加靈敏地測定骨髓MRD甚至外周血MRD水平，證實外周血作為MRD測定標本及危險分層依據的可行性極高。同時，與骨髓間歇采樣相比，增加外周血檢測頻率可擴大MRD動態監測范圍，有助于全面了解疾病緩解與復發情況。

多項研究[19-23]表明，不同時點的MRD水平對B-ALL患兒預后均具有預測價值。目前，臨床醫師大多選擇誘導治療中期、后期和鞏固治療期作為MRD檢測時點。本研究基于TARGET數據庫分析誘導治療更早期(第8天)MRD在兒童B-ALL預后評估中的價值，結果顯示，隨著誘導治療第8天外周血MRD水平的升高, B-ALL患兒5年EFS率降低; 聯合檢測誘導治療第8天外周血MRD與第29天骨髓MRD發現，雙陰性者預后最佳，單陽性者次之，雙陽性者預后最差，提示誘導治療第8天外周血MRD可作為第29天骨髓MRD的有益補充評估兒童B-ALL預后。進一步分析發現，在第29天骨髓MRD陰性患兒中，第8天外周血MRD≥0.10%者的5年EFS率顯著低于第8天外周血MRD<0.10%者，表明第8天外周血MRD≥0.10%的患兒即使在誘導治療第29天骨髓MRD轉為陰性，其預后仍然較差，這可能與該類患兒骨髓原始淋巴細胞清除緩慢有關。BOROWITZ M J等[10]研究顯示，在第29天骨髓MRD陰性患兒中，第8天外周血MRD≥1%者的5年EFS率較MRD<1%者降低。由此提示，本研究可進一步細化風險分層，識別出具有潛在高復發風險(第8天外周血MRD 0.10%～<1.00%)的患兒。本研究結果還顯示，在第29天骨髓MRD陽性患兒中，雖然第8天外周血MRD≥0.10%者的5年EFS率低于第8天外周血MRD<0.10%者，但2組間差異無統計學意義，考慮可能與第8天外周血MRD陰性患兒樣本量較少導致結果偏倚有關，今后還需進一步擴大樣本量深入研究。

綜上所述，誘導治療第8天外周血MRD在兒童B-ALL預后評估中具有重要的臨床意義，可作為第8天骨髓細胞形態和第29天骨髓MRD的強有力補充。但本研究所用數據源于國外早期回顧性資料，缺乏中國B-ALL患兒相關特征數據及進一步驗證結果，后續亟待開展關于中國兒童B-ALL誘導治療早期外周血MRD檢測的研究，從而制訂符合中國B-ALL患兒的最佳檢測策略。