circ_0000212靶向微小RNA-1283對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的影響

吳娜萍, 王 磊, 張 磊, 方 琦

(江蘇省常州市第一人民醫院 乳腺外科, 江蘇 常州, 213000)

三陰性乳腺癌(TNBC)是一種異質性乳腺癌亞型，具有高侵襲性、高轉移風險，其高侵襲性可導致患者預后不佳，引起高死亡風險，且由于臨床診療過程的復雜性和困難性，導致患者身體健康狀況低下，心理負擔加劇。確定潛在的分子靶點，研究新型小分子藥物對臨床治療TNBC具有一定的指導價值[1-3]。非編碼RNA參與TNBC腫瘤疾病發展過程，并發揮作用[4]。環狀RNA(circRNA)是非編碼RNA的一種，可通過多種機制在癌細胞的進展中發揮重要作用, circRNA具有高豐度、高穩定性以及特異性等特點，有望為腫瘤的診斷和治療提供新視角[5]。circ_0000212(circSFMBT2)來源于SFMBT2, 位于chr10: 7405839-7423911, 其充當微小RNA(miR)-1283-140-3p的海綿調控TCEB3, 進而促進宮頸癌的進展[6]。在胃癌組織和細胞中circSFMBT2表達上調，丹皮酚可通過circSFMBT2/miR-665軸抑制胃癌HGC-27細胞的增殖、遷移、侵襲和谷氨酰胺分解，并誘導細胞凋亡[7]。然而，目前有關circ_0000212對TNBC細胞活動的影響及相關機制的研究較少。生物學軟件預測發現circ_0000212與miR-1283有結合位點。研究[8]報道, miR-1283高表達通過靶向ATF4而有效抑制膠質瘤細胞的活動。下調circ-TTBK2, 可通過調節miR-1283和CHD1抑制膠質瘤的發展[9]。但miR-1283對TNBC細胞活動的具體影響并未明確，且其與circ_0000212之間的關系尚未闡明。本研究探討TNBC細胞中circ_0000212的表達情況及其對細胞增殖、凋亡生理過程的影響和作用機制。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取2017年1月—2021年1月常州市第一人民醫院經病理確診且相關信息完整的TNBC患者41例(年齡37～66歲)作為研究對象，取其手術切除的癌組織及癌旁組織進行深入分析，所有患者術前均未接受手術以及放療、化療, 41例患者及其家屬均知情并同意。本研究經倫理委員會審核批準[批準號: (2021)科132號)]。

1.2 細胞株與試劑

TNBC細胞株MDA-MB-231(美國ATCC); RPMI-1640培養基、凋亡檢測試劑盒(美國Sigma公司); Trizol試劑(美國Invitrogen); 熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物); CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所); RIPA蛋白裂解液(上海貝博-Bestbio); 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國AAT Bioquest)。

1.3 細胞處理與分組

MDA-MB-231細胞常規培養于RPMI-1640培養基中，將circ_0000121干擾表達載體及陰性對照、circ_0000121過表達載體及陰性對照、miR-1283模擬物及陰性對照轉染至MDA-MB-231細胞，記為si-circ_0000212組、si-NC組、pcDNA-circ_0000212組、pcDNA組、miR-1283組、miR-NC組; 在MDA-MB-231細胞共轉染circ_0000121干擾表達載體與miR-1283抑制劑或陰性對照，記為si-circ_0000212+anti-miR-1283組、si-circ_0000212+anti-miR-NC組。

1.4 反轉錄-實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測circ_0000212和miR-1283的表達水平

提取TNBC組織、癌旁組織及各組MDA-MB-231細胞的總RNA, 合成cDNA后，按照熒光定量PCR試劑盒說明進行PCR，PCR反應體系: 2.0 μL反轉錄產物、10.0 μL SYBR Green Mix和上、下游引物各0.5 μL, 7.0 μL無菌水; 循環條件: 95 ℃預變性2 min, 95 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共40個循環; 融解曲線: 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s, 95 ℃ 15 s。相對表達量用2-△△Ct法計算。內參為U6、GAPDH, 引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 CCK-8檢測細胞活性

各組MDA-MB-231細胞在96孔板中持續培養1、2、3 d后，分別加入CCK-8試劑10 μL, 持續孵育2 h, 應用酶標儀檢測光密度值(OD), 波長參數為450 nm。

1.6 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數

取對數生長期MDA-MB-231細胞，以每孔500個細胞接種于6孔板中，每組設3個復孔，培養2周出現肉眼可見克隆時終止培養，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍，用甲醇固定細胞15 min, 然后施加結晶紫進行染色，時間30 min，顯微鏡下計數>50個細胞的集落。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集各組培養48 h的MDA-MB-231細胞，預冷的PBS漂洗2次，加入300 μL的結合緩沖液，并進行細胞重懸，然后分別加入5 μL的碘化丙啶(PI)、Annexin V-FITC并充分混勻，置于避光環境中持續孵育10 min, 采用流式細胞儀計算細胞凋亡率，上機前，補加200 μL的結合緩沖液。

1.8 活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(cleaved-caspase3)、活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9(cleaved-caspase9)蛋白水平測定

采用RIPA蛋白裂解液提取MDA-MB-231細胞總蛋白，各組蛋白上樣量50 μg。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，然后將蛋白轉至聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入cleaved-caspase3、cleaved-caspase9抗體4 ℃孵育過夜; 洗膜后加入二抗室溫孵育2 h, 暗室中曝光顯影，再浸入定影液，成像后用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.9 雙熒光素酶報告實驗

擴增含有miR-1283互補位點的野生型(WT)-circ_0000212序列或突變型(MUT)-circ_0000212序列，將其插入pGL3熒光素酶報告基因載體，合成WT-circ_0000212和MUT-circ_0000212熒光素酶載體。在接種于96孔板的MDA-MB-231細胞中，分別將miR-NC、miR-1283與WT-circ_0000212和MUT-circ_0000212進行共轉染，轉染48 h后，測量螢火蟲和海腎熒光素酶活性，并將海腎熒光素酶活性用作對照。熒光素酶活性測定相關操作嚴格按照說明書完成。

將circ_0000121干擾表達載體、過表達載體及陰性對照轉染至MDA-MB-231細胞，用RT-qPCR檢測miR-1283的表達水平。

1.10 統計學分析

2 結 果

2.1 circ_0000212和miR-1283在TNBC組織、癌旁組織中的表達

應用RT-qPCR檢測組織中circ_0000212和miR-1283的表達水平，結果顯示, circ_0000121在TNBC組織中的表達水平高于癌旁組織, miR-1283表達水平低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 circ_0000212和miR-1283在TNBC組織中的表達

2.2 干擾circ_0000212表達對TNBC MDA-MB-231細胞增殖的影響

轉染si-circ_0000212后，應用RT-qPCR檢測circ_0000121表達水平，結果顯示circ_0000121表達水平降低，表明轉染成功。進一步通過CCK-8法及克隆形成實驗檢測細胞活力及克隆數，結果顯示，轉染si-circ_0000212后，MDA-MB-231細胞活力水平降低，細胞克隆活動呈下降態勢(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 干擾circ_0000212表達對TNBC MDA-MB-231細胞克隆形成的影響

表3 干擾circ_0000212表達對TNBC MDA-MB-231細胞增殖的影響

2.3 干擾circ_0000212表達對TNBC MDA-MB-231細胞凋亡的影響

轉染si-circ_0000212后，分別用流式細胞術及蛋白免疫印跡法檢測細胞凋亡及蛋白表達水平，結果顯示, si-circ_0000212組MDA-MB-231細胞凋亡率以及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達水平高于si-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表4。

A: 凋亡相關蛋白表達; B: 細胞凋亡流式圖。圖2 干擾circ_0000212表達對TNBC MDA-MB-231細胞凋亡的影響

表4 干擾circ_0000212表達對TNBC MDA-MB-231細胞凋亡的影響

2.4 circ_0000212靶向調控miR-1283的表達

Circular RNA Interactome預測circ_0000212與miR-1283互補的核苷酸序列見圖3。WT-circ_0000212與miR-1283共轉染的MDA-MB-231細胞熒光素酶活力呈下降態勢(P<0.05), 而MUT-circ_0000212與miR-1283共轉染的MDA-MB-231細胞熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05), 見表5。

表5 各組的細胞熒光素酶活性測定結果

圖3 circ_0000212與miR-1283互補的核苷酸序列

RT-qPCR檢測結果顯示, miR-1283在pcDNA-circ_0000212組的表達水平低于pcDNA組，差異有統計學意義(P<0.05); miR-1283在si-circ_0000212組的表達水平高于si-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 circ_0000212調控miR-1283的表達

2.5 miR-1283過表達對TNBC MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的影響

轉染miR-1283后，用RT-qPCR檢測miR-1283表達水平，結果顯示miR-1283表達水平升高，表明轉染成功。然后分別通過CCK-8法及克隆形成實驗檢測細胞活力及克隆數，流式細胞術及蛋白免疫印跡法檢測細胞凋亡及蛋白表達水平，結果顯示, MDA-MB-231細胞活力度降低，細胞克隆活躍度呈下降態勢(P<0.05); miR-1283組MDA-MB-231細胞凋亡率以及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表達水平高于miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4、表7。

A: miR-1283過表達對TNBC MDA-MB-231細胞克隆形成的影響; B: miR-1283過表達對TNBC MDA-MB-231細胞凋亡相關蛋白表達的影響; C: miR-1283過表達對TNBC MDA-MB-231細胞凋亡的影響。圖4 miR-1283過表達對TNBC MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的影響

表7 miR-1283過表達對TNBC MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的影響

2.6 下調miR-1283表達逆轉了干擾circ_0000212表達對TNBC MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的作用

RT-qPCR、CCK-8法、克隆形成實驗、流式細胞術及蛋白印跡法檢測結果顯示, si-circ_0000212+anti-miR-1283組miR-1283 水平低于si-circ_0000212+anti-miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05); MDA-MB-231細胞活力度、細胞克隆活力度呈上升態勢(P<0.05); si-circ_0000212+anti-miR-1283組MDA-MB-231細胞凋亡率以及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表達水平低于si-circ_0000212+anti-miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5、表8。

表8 下調miR-1283表達逆轉了干擾circ_0000212表達對TNBC MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的作用

3 討 論

在乳腺癌的治療中, TNBC頗具挑戰性，開發新的TNBC治療策略已成為臨床迫切需要，現階段靶向治療為TNBC治療提供了新思路[10-11]。研究[12]表明, circRNA在疾病中異常表達，可與miRNA相互作用，并對腫瘤的發生發展產生一定影響。有學者[13]在結直腸癌組織發現circ_0000212高表達，通過海綿miR-491調節FOXP4,實現對結直腸癌細胞增殖的促進作用。一項針對胃癌的研究[14]發現, circSFMBT2通過海綿狀miR-182-5p促進CREB1表達，誘導胃癌細胞增殖。本研究結果顯示，相比癌旁組織, circ_0000121在TNBC組織中呈現更高的表達水平，提示circ_0000121可能會成為TNBC中的癌基因。本研究干擾circ_0000212表達后，發現MDA-MB-231細胞活性衰退，細胞克隆活動減弱，而MDA-MB-231細胞凋亡率增高, cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表達水平呈上升態勢。提示干擾circ_0000212表達對MDA-MB-231細胞增殖具有明顯抑制作用，并可促進細胞凋亡，進而減緩TNBC的發展進程。

circRNA可充當miRNA海綿，與RNA結合蛋白相互作用，從而發揮重要的生物學功能; 生物學軟件預測顯示circ_0000212與miR-1283有結合位點。研究[15]報道, miR-1283高表達抑制HTR-8/SVneo細胞的浸潤、增殖，促進細胞凋亡。CircGprc5a通過抑制miR-1283的表達和激活YAP1/TEAD1信號通路促進肝癌的發展[16]。本研究結果顯示, miR-1283在TNBC組織中的表達水平低于癌旁組織，過表達miR-1283后MDA-MB-231細胞活性降低，細胞克隆形成數減少, MDA-MB-231細胞凋亡率以及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表達水平升高，提示miR-1283過表達對細胞增殖活動產生抑制作用，可促進細胞凋亡。此外，本研究證實了circ_0000212靶向調控miR-1283, 且下調miR-1283逆轉了干擾circ_0000212對MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的作用，提示circ_0000212可通過充當miR-1283的海綿分子，負向調節miR-1283表達，從而調控TNBC細胞增殖及凋亡，促進TNBC的發生發展。

綜上所述，干擾circ_0000212表達可能通過靶向上調miR-1283，抑制TNBC MDA-MB-231細胞增殖，并促進細胞凋亡。