結(jié)直腸癌組織中Rictor蛋白的表達及其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系

周義志, 張忠偉, 向立斌, 劉 巖, 王 碩, 曹美楠

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第962醫(yī)院, 黑龍江 哈爾濱, 150086)

結(jié)直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年升高趨勢。近年來，隨著治療方法的進步，結(jié)直腸癌患者的預(yù)后得以改善，但分期較晚、遠處轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后仍不佳[1]。因此，探尋結(jié)直腸癌早期診斷與預(yù)后評估相關(guān)的分子標志物成為該研究領(lǐng)域的熱點。Rictor蛋白是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2(mTORC2)的成員，參與調(diào)控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路。相關(guān)研究[2]表明, Rictor蛋白在結(jié)腸癌組織中高表達，與結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。另有研究[3-4]提出，微小RNA-152(miR-152)和微小RNA-448(miR-448)可靶向調(diào)控Rictor蛋白而抑制結(jié)直腸癌細胞增殖。本研究觀察Rictor蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達情況，并分析其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年6月—2018年6月在本院接受結(jié)直腸癌根治術(shù)治療并經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診的90例結(jié)直腸癌患者作為研究對象。納入標準: ① 臨床資料、病理數(shù)據(jù)無缺失者; ② 經(jīng)病理明確診斷結(jié)直腸癌者; ③ 術(shù)前未接受放化療、免疫治療等抗腫瘤治療者; ④ 對本研究知情并簽訂書面同意書者。排除標準: ① 存在其他器官惡性腫瘤者; ② 懷孕期或哺乳期女性; ③ 近期接受過免疫抑制劑治療，或存在嚴重感染者。90例患者中，男51例，女39例; 年齡44～78歲，平均(60.6±12.3)歲; 腫瘤部位為左側(cè)結(jié)腸28例、右側(cè)結(jié)腸31例、直腸31例; TNM分期為Ⅰ期30例、Ⅱ期40例、Ⅲ期20例; 腫瘤最大直徑為1.5～5.5 cm, 平均(2.9±1.3) cm; 分化程度為低分化23例、中分化49例、高分化18例; 合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例; 浸潤深度為T1期10例、T2期11例、T3期42例、T4期27例。收集90例患者的結(jié)直腸癌組織標本，并取對應(yīng)的距癌組織5 cm處的正常結(jié)直腸組織作為對照，所有癌旁組織均經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色明確無癌細胞。

1.2 免疫組織化學(xué)方法

制備5 μm切片，實施脫蠟、脫水、水化等步驟，加入鼠抗人Rictor一抗(1∶50, 貨號ab1203, 美國Sigma公司)，置于4 ℃冰箱過夜，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗3次，加入兔抗鼠二抗(1∶100, 貨號M282, 大連寶生物有限公司), 37 ℃孵育30 min, 用PBS沖洗3次，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察。半定量分析評分方法[2]: ① 細胞質(zhì)染色強度評分，無黃染為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分; ② 陽性細胞百分比≤5%為0分, >5%～25%為1分, >25%～50%為2分, >50%～75%為3分, >75%為4分。以① 與② 評分乘積表示Rictor蛋白表達水平，參照全部患者的平均分值(4.23分)，將<4.23分判定為低表達, ≥4.23分判定為高表達。

1.3 隨訪方法

對所有患者進行隨訪(門診隨訪、電話隨訪等方式)，隨訪截止日期為2021年6月30日，隨訪時間為12～36個月，中位時間34個月，平均(34.1±8.0)個月，采用總體生存率對患者進行預(yù)后評價。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù), Rictor蛋白陽性表達情況、生存率等計數(shù)資料以[n(%)]、百分率(%)描述，比較行χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制結(jié)直腸癌組織Rictor蛋白低表達、高表達患者的生存曲線，采用Log-Rank檢驗對生存率進行比較，并采用單因素和多因素Cox回歸分析探討結(jié)直腸癌預(yù)后的影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Rictor蛋白在癌旁正常結(jié)直腸組織和結(jié)直腸癌組織中的表達情況

Rictor蛋白陽性表達細胞的染色表現(xiàn)為核周及細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。結(jié)直腸癌組織中Rictor蛋白陽性表達率為55.6%(50/90), 高于癌旁正常結(jié)直腸組織的11.1%(10/90), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=40.034,P<0.001)。見圖1。

2.2 結(jié)直腸癌組織中Rictor蛋白陽性表達與臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)直腸癌組織中Rictor蛋白陽性表達率與腫瘤最大直徑、浸潤深度、TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05), 與性別、年齡及腫瘤部位無關(guān)(P>0.05), 見表1。

2.3 Rictor蛋白表達與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

本研究90例結(jié)直腸癌患者均未失訪，結(jié)直腸癌組織Rictor蛋白低表達患者的總體生存率高于Rictor蛋白高表達患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖2。

圖2 結(jié)直腸癌組織Rictor蛋白低表達、高表達患者的生存曲線

2.4 結(jié)直腸癌患者預(yù)后的單因素、多因素Cox回歸分析

將患者是否死亡作為因變量，將性別(男、女)、年齡(<60歲、≥60歲)、腫瘤部位(右側(cè)結(jié)腸、左側(cè)結(jié)腸、直腸)、Rictor蛋白(低表達、高表達)、腫瘤最大直徑(<3 cm、≥3 cm)、浸潤深度(T1～T2期、T3～T4期)、TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期)、分化程度(高分化、低中分化)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有、無)作為自變量，進行單因素、多因素Cox回歸分析。分析結(jié)果顯示, Rictor蛋白高表達、TNM分期Ⅲ期是結(jié)直腸癌患者死亡的獨立危險因素(P<0.05), 見表2。

表2 結(jié)直腸癌患者預(yù)后的單因素、多因素Cox回歸分析

3 討 論

結(jié)直腸癌是一種異質(zhì)性腫瘤，其機制目前尚未闡明。基因組學(xué)研究[5]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中眾多基因呈差異性表達。盡管免疫靶向治療等治療手段可大大改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，提升患者的生活質(zhì)量，但目前臨床尚未發(fā)現(xiàn)有效的分子靶點。大量研究[6-8]發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤深度、TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征與結(jié)直腸癌預(yù)后有關(guān)。因此，尋找與臨床病理特征及預(yù)后有關(guān)的分子標志物對于結(jié)直腸癌的早期診斷和預(yù)后評估具有重要意義。

Rictor蛋白屬于mTORC2的成員，在腫瘤增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等過程中發(fā)揮著重要作用[9-11]。研究[12]發(fā)現(xiàn), Rictor蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達，是患者預(yù)后的獨立危險因素。此外, Rictor蛋白在多種消化道腫瘤組織中高表達，且與患者的預(yù)后有關(guān)[13-15]。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)直腸癌組織中Rictor蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)Rictor蛋白在結(jié)直腸癌組織中高表達，與相關(guān)研究[16]結(jié)論基本一致。黃仕思等[17]研究發(fā)現(xiàn)，沉默Rictor表達可抑制肝癌細胞的惡性生物學(xué)行為及EMT過程。由此推測, Rictor可能通過促進EMT而增加腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為。

臨床病理特征是反映腫瘤進展和預(yù)測腫瘤患者預(yù)后的可靠指標。本研究分析Rictor蛋白與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系后發(fā)現(xiàn), Rictor蛋白陽性表達率與腫瘤最大直徑、浸潤深度、TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示Rictor蛋白與結(jié)直腸癌惡性生物學(xué)行為有關(guān)。本研究結(jié)果顯示, Rictor蛋白高表達患者的總體生存率低于Rictor蛋白低表達患者，且Rictor蛋白高表達是結(jié)直腸癌患者死亡的獨立危險因素。由此提示, Rictor蛋白高表達可能與結(jié)直腸癌患者的低生存率有關(guān)，推測Rictor蛋白通過調(diào)控腫瘤細胞EMT促進細胞侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)過程，進而影響患者的預(yù)后[18]。但Rictor蛋白對結(jié)直腸癌的影響有待細胞功能實驗和動物實驗證實，且其具體作用機制也有待探索。

綜上所述, Rictor蛋白在結(jié)直腸癌組織中高表達，且Rictor蛋白表達情況與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征和預(yù)后有關(guān)，但Rictor蛋白通過何種通路發(fā)揮作用尚需進一步開展體內(nèi)外實驗加以明確。