重金屬鎘與氨基酸類單體相互作用的親合方式和驅動力研究

于勁松， 周栩丹， 王晗玥， 葉 泰， 吳秀秀， 曹 慧，袁 敏， 徐 斐， 肖誠傲， 楊 琦

上海理工大學 健康科學與工程學院，上海 200093

重金屬鎘是人體的非必需元素，它的特性是有毒、致癌和致突變，在國際癌癥研究機構的致癌物清單中，它屬于I類致癌物[1, 2]。此外，鎘元素還具有蓄積特性，半衰期可達數十年以上，一旦被人體吸收則很難清除[3]。鎘進入人體的途徑包括消化道、呼吸道等[4]。空氣中含有的鎘可通過呼吸道被人體吸收，食物中污染的鎘可通過消化道進入人體產生蓄積[5, 6]。目前，有關重金屬鎘的檢測方法最常見的有：原子吸收分光光度法(AAS)，電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)[7-9]。這兩種方法所需要的設備比較昂貴，適用于實驗室進行相關的檢測研究。但在實際的生產生活中，還需要開發一些快速簡便的方法，而進行檢測方法的開發，需要對鎘導致對人體產生危害的機理進行研究[10, 11]。目前，已有相關的鎘導致人體中毒的機理研究，但是采用熱力學方法的研究內容還較少。眾所周知，人體的組成離不開蛋白質，而氨基酸又是構成人體所需蛋白質的基本物質。因此，研究氨基酸和重金屬鎘的結合機理，對于了解鎘對人體的危害具有重要的意義[12, 13]。

等溫滴定量熱法是研究物質結合的金標準[14-16]，本文采用該方法研究了重金屬鎘與人體必需的20種氨基酸的結合過程，并探討了環境條件(緩沖液pH、緩沖液離子強度、溫度)變化對鎘與氨基酸親合過程的影響。本文的研究內容從熱力學的角度解釋了鎘與氨基酸類功能單體的親合機制，是鎘與氨基酸結合研究的重要理論補充，也可為鎘導致人體中毒機理的研究提供一定的參考，為后續鎘離子檢測方法的開發打下了基礎。

1 試驗設計

1.1 材料與設備

氨基酸：苯丙氨酸、異亮氨酸、精氨酸脯氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、頡氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、絲氨酸、甘氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、色氨酸，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，氫氧化鈉，均購自國藥基團化學試劑有限公司；等溫滴定量熱儀(VPITC)(美國馬爾文儀器有限公司)，pH計(S210-K，梅特勒托利多)。

1.2 氨基酸類單體與鎘相互作用的等溫滴定量熱試驗設計

在VPITC型等溫滴定量熱儀上進行等溫滴定試驗，首先為確保儀器的穩定性和未被污染，先進行水滴水試驗，水滴水試驗正常后正式進行試驗。第一步，先將300 μL濃度為10 mmol/L的氯化鎘溶液裝入到VPITC的注射器中，然后再使用進樣針向反應池中注入1 448 μL一定濃度的單體溶液，試驗中設置反應溫度至25 ℃，控制攪拌速度控制為372 r/min，滴定間隔控制為150 s，共滴定20次。試驗在VPITC基線穩定后開始正式滴定，滴定試驗結束后，使用VPITC自帶的軟件對結果進行擬合分析。為扣除試驗背景結果帶來的影響，每次試驗后進行氯化鎘滴定緩沖液試驗，每個結果均扣除背景。

2 結果與討論

2.1 氨基酸類功能單體與鎘相互作用的親合方式和驅動力

進行了一個系統的等溫滴定量熱法(ITC)研究，分析了重金屬鎘離子滴加到20種基本氨基酸的等溫滴定量熱曲線，實驗結果如圖1所示。

圖1 鎘離子滴定20種氨基酸的等溫滴定量熱曲線(298 K)

將圖1中上半部分的熱量進行積分得到下半部分的點圖，之后再運用合適的模型對各點進行擬合，得到親合力(K), 化學計量比(N) 和反應焓變(ΔH)，結果如表1所示。從K值來看，半胱氨酸與鎘親和的K值最大，達到了106水平，表明氨基酸中半胱氨酸與鎘的親和力最強；其次是結構中含有咪唑基團的組氨酸，K值達到了103，之后是天冬氨酸和蘇氨酸。與上述幾個氨基酸相比，其他幾個氨基酸與鎘親合的K值、焓變(ΔH)都不高。REMELLI M等人[17]研究了Cd(II)與其他二價過渡金屬離子在與氨基酸、多肽和螯合劑形成絡合物過程中的競爭關系，其研究結果顯示：通過比較積累穩定常數(log β110)，各氨基酸與鎘結合物的穩定性排序為cys(12.82)>his(5.74)>asp(4.35)>gly(4.24)，這與本文得到的各氨基酸與鎘的親和力結果排序是一致的。

表1 鎘與氨基酸類功能單體結合的熱力學參數分析

結合表1中焓變(ΔH)和熵變(ΔS)數據，根據表2中的公式(ΔG=ΔH-TΔS)，可以得到每種氨基酸與鎘結合的驅動力類型[18]：除半胱氨酸存在焓熵雙驅動外，其他氨基酸與鎘結合的驅動力都是熵驅動。參考相關文獻，還可以獲知各個氨基酸與鎘的親合作用方式：除半胱氨酸與鎘存在配位作用外，其他氨基酸與鎘的結合均為靜電相互作用(注：脯氨酸與鎘不存在相互作用)。

表2 化學反應驅動力及自發性的判斷

為了驗證氨基酸與鎘結合的具體基團，研究了二硫蘇糖醇(DTT)、二水合檸檬酸三鈉(Sodium citrate)和三羥甲基氨基甲烷(Tris)與鎘的結合ITC試驗，結果如圖2所示。

圖2 DTT(左)、二水合檸檬酸三鈉(中)和Tris(右)與鎘的結合ITC試驗研究

從圖2中結果發現，二硫蘇糖醇與鎘的結合為放熱且放熱信號明顯大于Cys，可以確認巰基與鎘的結合為放熱；含有相當于三個羧基的二水合檸檬酸三鈉，相比圖1中的甘氨酸和天冬氨酸，顯示的結合信號也是吸熱，但是信號更強，表明羧基與鎘的結合為吸熱，且吸熱強度與羧基的數量成正比。對于結構中沒有羧基，只有氨基和羥基的Tris來說，它與鎘的結合信號微弱。由表3可見，結構中含有兩個巰基的二硫蘇糖醇與鎘親合的作用方式為配位鍵，驅動力為焓熵雙驅動，氨基酸中只有半胱氨酸(結構中含有一個巰基)的作用方式和驅動力與之相同，有次可以推測半胱氨酸與鎘的親合主要是通過巰基與鎘離子之間形成配位鍵實現的。Elena Chekmeneva等人[19]研究了結構中也含有巰基的谷胱甘肽(GSH)與鎘離子的親合過程：在pH 7.4的Tris緩沖液中，采用5 mmol/L的鎘滴定0.2 mmol/L的GSH，其滴定圖譜同樣顯示為一個放熱過程，其放熱焓變(ΔH)為-20.8 kcal/mol。本研究中的親合反應是在HEPES中進行的，采用2 mmol/L的鎘液滴定0.05 mmol/L半胱氨酸溶液，其放熱焓變(ΔH)為-2.38 kcal/mol(表1)；采用2 mmol/L的鎘液滴定0.05 mmol/L二硫蘇糖醇溶液，其放熱焓變(ΔH)為-4.18 kcal/mol(表3)，雖然反應環境不同，但含巰基單體與鎘的熱力學行為和參數是一致的。

表3 鎘與氨基酸類功能單體結合的熱力學參數分析

2.2 pH、離子強度、溫度等條件對鎘與半胱氨酸親合的作用方式和驅動力影響

在前面研究的基礎上，以半胱氨酸為對象，研究了pH、離子強度、溫度等環境條件變化對鎘與半胱氨酸相互作用的親合方式和驅動力影響。首先，采用ITC方法，考察了在25 ℃溫度下，不同pH條件下，鎘與半胱氨酸結合的差異，結果見圖3和圖4。

圖3 不同pH下(Mes緩沖液)Cd(II)與半胱氨酸結合的ITC試驗

圖4 不同pH下(HEPES緩沖液)Cd(II)與半胱氨酸結合的ITC試驗

從圖3可以看出，隨著pH的降低，Cd(II)與半胱氨酸結合的放熱量在逐漸降低，MES緩沖液的有效pH范圍是5.5～6.7，降低pH不利于二者的結合。進一步采用HEPES緩沖體系考察了在pH 6.8～8.2范圍內Cd(II)與半胱氨酸結合的情況，結果如圖4和表4所示。

表4 不同pH下Cd(II)與半胱氨酸結合的ITC試驗數據(25 ℃)

需要說明的是，在pH8.2條件下，Cd(II)是無法長時間穩定存在的，在若干分鐘內即會出現絮狀懸浮物，這應該是由于在該堿性pH條件下的Cd(II)與環境中的OH-結合生成Cd(OH)2不溶物造成的。在中性和酸性條件下則沒有出現此現象。由表4可見pH低于7.5時，鎘與半胱氨酸結合的作用方式為配位鍵，驅動力為焓熵雙驅動；pH大于等于7.5時，作用方式為兩種，增加了靜電相互作用，驅動力也是焓熵雙驅動和熵驅動兩種方式。可見，pH的變化對于鎘與半胱氨酸的親合過程影響還是非常明顯的。

在上述pH條件研究的基礎上，選擇pH 6.0，研究了緩沖液離子強度對Cd(II) 與半胱氨酸親合過程的影響，結果如圖5所示。

圖5 離子強度變化對Cd(II)與半胱氨酸結合的ITC試驗

由圖5和表5可見，在相同pH(6.0)、相同反應溫度(25 ℃)的情況下，改變離子強度，半胱氨酸與Cd(II)的相互作用強度沒有明顯的差異。隨著離子強度的升高，相互作用的焓變略微增加，但二者親合的作用方式和驅動力并未發生變化。總體來說，該范圍內離子強度的變化對二者的結合影響很小。

表5 不同離子強度下Cd(II)與半胱氨酸結合的ITC試驗數據(25 ℃)

在前述研究的的基礎上，采用離子強度為25 mmol/L pH 6.0的Mes緩沖體系，考察了不同溫度下(25 ℃、35 ℃和45 ℃)鎘與半胱氨酸結合的差異，結果見圖6。

圖6 不同溫度下(25 ℃、35 ℃和45 ℃)Cd(II)與半胱氨酸結合的ITC試驗

從圖6和表6中可見，隨著溫度逐漸升高，二者的結合產生的熱量值(ΔH)有逐漸變小的趨勢，親合力K值也是逐漸降低。推測升高溫度，不利于二者的結合。此外，溫度變化(25 ℃～40 ℃)并未改變鎘離子與半胱氨酸親合時的作用方式和驅動力，仍為配位鍵結合和焓熵雙驅動方式。

表6 不同溫度下Cd(II)與半胱氨酸結合的ITC試驗數據(pH=6.0)

3 結論

本文采用等溫滴定量熱法，研究了重金屬鎘與氨基酸類單體相互作用的親合方式、驅動力，并探討了環境條件變化對二者親合的影響。結果顯示：除脯氨酸外，其它氨基酸與鎘離子都可以相互親合。

各氨基酸在與鎘的結合過程中，巰基為放熱結合位點，結合能力最強；羧基為吸熱結合位點，結合能力次之；氨基為微弱的吸熱位點，結合能力最差，基本無結合。組氨酸中的咪唑基團與鎘的結合作用，要明顯大于羧基；咪唑基團與鎘離子的結合是一個吸熱結合。半胱氨酸與鎘離子的親合能力最強，二者的作用方式為配位鍵和靜電相互作用，驅動力為焓熵雙驅動和熵驅動兩種；其他氨基酸與鎘的作用方式均為靜電相互作用，驅動力為熵驅動，所有的親合過程均是可以自發進行的。

在pH 5.5～8.2范圍內，低pH 5.5和高pH 8.2不利于Cd(II)與半胱氨酸的結合，酸性環境有利于Cd(II)的穩定存在，偏堿的條件Cd(II)易與環境中的OH-結合生成Cd(OH)2不溶物。pH 6.0～7.5范圍利于Cd(II)與半胱氨酸的結合。升高溫度(25 ℃、35 ℃和45 ℃)，并不有利于Cd(II)與半胱氨酸的放熱結合。離子強度的變化(25 mmol/L～100 mmol/L)對Cd(II)與半胱氨酸的結合影響很小。

本文從熱力學的角度解釋了鎘與氨基酸類功能單體的親合機制，明確了氨基酸和鎘親合的親合方式和驅動力，是鎘與氨基酸結合過程研究的重要理論補充，也為重金屬導致人體中毒機理的機理研究提供一定的參考。此外，氨基酸類功能單體與鎘親合過程的探索，有助于有關重金屬鎘的檢測過程中的識別元件的制備研究，為后續鎘離子檢測方法的開發提供重要的試驗和理論指導。