基于PI3K/AKT通路探討水蛭、地龍?zhí)崛∥飳CAO/R小鼠腦缺血半暗帶神經(jīng)元的保護作用*

趙磊，袁慶，張彤，賈壯壯，殷孟蘭，胡利民

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，組分中藥國家重點實驗室，天津市中藥藥理學(xué)重點實驗室，方劑學(xué)教育部重點實驗室，天津 301617）

缺血性腦卒中具有高發(fā)病率、高病死率和高致殘率的特點，是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1-2]。缺血后血流再通導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷（CIRI）是缺血性腦卒中主要的致病原因，其病理機制包括：氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)，線粒體損傷、Ca2+超載、細胞凋亡等[3]。

水蛭是破血消癥的代表藥，具有破血通經(jīng)，逐淤消癥的功效。主要含有蛋白質(zhì)及多肽類大分子、氨基酸等有效成分。現(xiàn)代藥理研究表明，水蛭具有改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、溶栓、降低血液黏稠度等作用[4-5]。地龍是平肝熄風(fēng)的代表中藥，具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘的功效。主要含有蛋白質(zhì)，核苷酸和氨基酸等有效成分。研究表明，地龍具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血栓、抗肺纖維化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[6]。水蛭和地龍及其中成藥制劑，如復(fù)方地龍片、疏血通注射液、腦血康、腦血栓片等廣泛用于臨床上中風(fēng)等疾病的治療[7]。本研究目的在于探討水蛭地龍通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路，進而減輕MCAO/R小鼠腦缺血半暗帶神經(jīng)元損傷的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/cnc小鼠，雄性，體質(zhì)量（20±5）g；北京維通利華實驗動物公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。

1.2 藥品與試劑 水蛭提取液、地龍?zhí)崛∫河赡档そ巡帢I(yè)有限責(zé)任公司提供，B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2，ab196495）、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白（Bax，ab199677）、Cleaved Caspase-3（ab49822）、神經(jīng)特異核蛋白（NeuN，ab177487）、β-actin（ab179467），英國 Abcam公司生產(chǎn)；磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K，17366）、p-AKT（4060）、蛋白激酶 B（AKT，4685），MAP2（4542S）美國Cell Signaling Technology公司生產(chǎn)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 主要儀器 蛋白免疫印跡（Western-blot）電泳儀，美國Bio-Rad公司；Trans-Blot轉(zhuǎn)膜儀，美國Invitrogen公司；全自動封閉脫水機，德國LEICA公司；病理切片機，德國LEICA公司；Leica 750生物顯微鏡，德國LEICA公司；Eclipse Ti倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；Amersham imager 600超靈敏多功能成像儀，美國General Electric公司。

1.4 分組與給藥 將40只C57BL/cnc小鼠采用隨機數(shù)字表法分為，假手術(shù)組（Sham組）、腦缺血再灌注組（MCAO/R組）、水蛭提取液組（Leech組，0.8g生藥/kg）、地龍?zhí)崛∫航M（Earthworm組，0.8 g生藥/kg）共4組，尾靜脈注射給藥，每日1次，連續(xù)給藥7 d，Sham組與MCAO/R組給予相同容積生理鹽水。

1.5 MCAO/R模型制備 手術(shù)前，小鼠被禁食12 h，可自由獲取飲用水。2%異氟烷持續(xù)麻醉小鼠，線栓法[8]建立大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）模型，手術(shù)過程中小鼠肛溫保持（37.0±0.5）℃，室溫維持（27.0±0.5）℃。消毒備皮后，沿頸部正中切開皮膚，暴露頸總動脈、頸外動脈，夾閉頸總及頸外動脈，在頸外動脈近心端剪一V型切口，鈍性分離頸內(nèi)動脈，將線栓沿頸外動脈經(jīng)頸內(nèi)動脈推至距離分叉（10±3）mm，插至大腦中動脈，系緊頸外動脈游離端，缺血1.5 h后拔出線栓，實現(xiàn)再灌。Sham組不做插線栓處理，其余操作同MCAO/R組。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1 神經(jīng)行為學(xué)評分 采用mNSS評分[9]，連續(xù)給藥7d后，觀察各組小鼠神經(jīng)功能缺損情況，包括運動測試、感覺測試、平衡測試、反射測試和異常運動5個方面，共18分，分?jǐn)?shù)越高說明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.6.2 蘇木精-伊紅（HE）染色及Nissl染色 異氟烷麻醉處死小鼠，心臟灌注生理鹽水及4%多聚甲醛溶液，取出的腦組織經(jīng)固定、脫水、包埋及切片。腦切片進行常規(guī)HE染色及Nissl染色，Leica 750生物顯微鏡下觀察。

1.6.3 TUNEL染色檢測腦缺血半暗帶細胞凋亡情況 各組小鼠腦石蠟切片參照試劑盒操作說明進行TUNEL染色，于倒置熒光顯微鏡下觀察缺血半暗帶細胞凋亡情況。細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)量/總細胞數(shù)量×100%。

1.6.4 免疫熒光法檢測腦缺血半暗帶Bcl-2、Bax陽性細胞表達 小鼠斷頭取腦，心臟灌注生理鹽水及4%多聚甲醛溶液，固定、脫水及包埋，制備石蠟切片。切片經(jīng)脫蠟，水化，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗10 min，3% H2O2孵育8 min，放入檸檬酸鈉溶液中抗原修復(fù)，滴加山羊血清封閉，4℃孵育Bcl-2、Bax一抗過夜，次日加入相應(yīng)FITC標(biāo)記的二抗，37℃避光孵育40 min，DAPI避光染核 10 min，封片；鏡下觀察，隨機選取5個高倍視野拍照，統(tǒng)計陽性細胞表達數(shù)。

1.6.5 Western-Blot法檢測腦缺血半暗帶PI3K、p-AKT、AKT、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Caspase-3、NeuN、MAP2蛋白表達情況 提取各組小鼠腦缺血半暗帶總蛋白，BCA測定蛋白濃度。蛋白樣品添加至SDS-PAGE凝膠孔道，在電壓100V下電泳25min后，換80 V電壓電泳60 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，將PVDF膜與PI3K、p-AKT、AKT、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Caspase-3、β-actin、NeuN、MAP2 一抗結(jié)合，4 ℃孵育過夜。次日，用對應(yīng)HRP標(biāo)記二抗于室溫下孵育1 h，TBST洗膜，顯影。Image J軟件分析目的蛋白/β-actin的相對表達情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對MCAO/R小鼠神經(jīng)功能缺損的影響 給藥7 d后，與Sham組比較，MCAO/R組mNSS評分升高（P<0.01）；與MCAO/R組比較，水蛭和地龍給藥組mNSS評分顯著下降（P<0.01），神經(jīng)功能缺損情況得到改善。見圖1。

圖1 各組小鼠神經(jīng)功能評分（n＝10，±s）Fig.1 mNSS of mice in each group(n=10，±s)

2.2 對小鼠腦缺血半暗帶組織形態(tài)學(xué)的影響 HE染色結(jié)果表明，與Sham組相比，MCAO/R組細胞排列不齊、間隙疏松，組織結(jié)構(gòu)松散、損傷嚴(yán)重；與MCAO/R組相比，水蛭和地龍給藥組細胞排列整齊，組織形態(tài)明顯改善。見圖2。

圖2 各組小鼠腦缺血半暗帶HE染色情況Fig.2 HE staining image of cerebral ischemic penumbra of mice in each group

2.3 對小鼠腦缺血半暗帶神經(jīng)元損傷的影響 Nissl染色表明，與Sham組相比，MCAO/R組受損神經(jīng)元數(shù)目增多，Nissl體數(shù)目減少（P<0.01）；與 MCAO/R組相比，水蛭和地龍給藥組神經(jīng)元形態(tài)相對正常，受損尼氏體數(shù)目減少（P<0.01）。Western-blot結(jié)果表明，與Sham組比較，MCAO/R組小鼠腦缺血半暗帶NeuN和MAP2蛋白表達降低（P<0.01），與MCAO/R組比較，水蛭和地龍給藥組小鼠腦缺血半暗帶NeuN和MAP2蛋白表達顯著上升（P<0.05或P<0.01）。見圖 3、4。

圖3 各組小鼠腦缺血半暗帶尼氏染色情況（n＝5，±s）Fig.3 Nissl staining image of cerebral ischemic penumbra of mice in each group(n＝5，±s)

圖4 各組小鼠腦缺血半暗帶NeuN、MAP2表達情況（±s，n=3）Fig.4 Expression of NeuN，MAP2 of cerebral ischemic penumbra of mice in each group（±s，n=3）

2.4 對小鼠腦缺血半暗帶細胞凋亡情況 TUNEL染色結(jié)果表明，Sham組大腦皮層幾乎無細胞凋亡；MCAO/R組TUNEL陽性細胞表達增多（P<0.01）；與MCAO/R組相比，水蛭和地龍給藥組TUNEL陽性細胞減少，細胞凋亡率下降（P<0.05或P<0.01）。見圖5。

圖5 各組小鼠腦缺血半暗帶細胞凋亡率（n=5，±s）Fig.5 Apoptois of cerebral ischemic penumbra of mice in each group(n=5，±s)

2.5 對小鼠腦缺血半暗帶Bcl-2、Bax表達情況 免疫熒光結(jié)果顯示，與Sham組比較，MCAO/R組小鼠腦缺血半暗帶Bcl-2陽性細胞減少（P<0.01），Bax陽性細胞顯著增加（P<0.01）；與MCAO/R組比較，水蛭和地龍給藥組Bax陽性細胞數(shù)表達降低（P<0.01），Bcl-2陽性細胞數(shù)表達升高（P<0.01）。Western-blot結(jié)果表明，與Sham組比較，MCAO/R組小鼠腦缺血半暗帶Bcl-2/Bax相對蛋白表達降低（P<0.01）；與MCAO/R組相比，水蛭和地龍給藥組Bcl-2/Bax相對蛋白表達升高（P<0.05）。見圖 6、7。

圖6 各組小鼠腦缺血半暗帶Bcl-2、Bax陽性細胞數(shù)（±s，n=5）Fig.6 The positive expression of Bcl-2，Bax of cerebral ischemic penumbra of mice in each group（±s，n=5）

圖7 各組小鼠腦缺血半暗帶Bcl-2、Bax表達情況（±s，n=3）Fig.7 Expression of Bcl-2，Bax of cerebral ischemic penumbra of mice in each group（±s，n=3）

2.6 對小鼠腦缺血半暗帶Cleaved Caspase-3、Caspase-3蛋白表達情況 Western-blot結(jié)果表明，與Sham組比較，MCAO/R組小鼠腦缺血半暗帶Cleaved Caspase-3/Caspase-3相對蛋白表達升高（P<0.05）；與MCAO/R組比較，水蛭和地龍給藥組Cleaved Caspase-3/Caspase-3相對蛋白表達降低（P<0.05或P<0.01）。見圖8。

圖8 各組小鼠腦缺血半暗帶Cleaved Caspase-3、Caspase-3 表達情況（±s，n=3）Fig.8 Expression of Cleaved-Caspase-3/Caspase-3 of cerebral ischemic penumbra of mice in each group（±s，n=3）

2.7 對小鼠腦缺血半暗帶PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達情況 Western-blot結(jié)果表明，與Sham組相比，MCAO/R組小鼠腦缺血半暗帶PI3K蛋白表達下降（P<0.05）；p-AKT/AKT相對蛋白表達降低（P<0.05），與MCAO/R組比較，水蛭和地龍給藥組p-AKT/AKT相對蛋白表達升高（P<0.05），PI3K蛋白表達上升（P<0.05）。見圖9。

圖9 各組小鼠腦缺血半暗帶PI3K、p-AKT、AKT表達情況（±s，n=3）Fig.9 Expression of PI3K、p-AKT/AKT of cerebral ischemic penumbra of mice in each group（±s，n=3）

3 討論

缺血性腦卒中后再灌注損傷，可能誘發(fā)鈣離子超載、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡過度等，影響機體穩(wěn)態(tài)[10]。在正常狀況下，受損及死亡的細胞在凋亡作用下被清除，維持體內(nèi)正常細胞數(shù)量的穩(wěn)態(tài)，但當(dāng)受到過度刺激或者處于不利環(huán)境下，凋亡水平將發(fā)生改變，進而影響機體穩(wěn)態(tài)[11]。腦缺血再灌注后神經(jīng)元主要以細胞凋亡的方式受損并死亡，其中以遲發(fā)性神經(jīng)元損傷為主[12]。線粒體是細胞凋亡的早期場所，腦缺血再灌注損傷會導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)破壞，釋放細胞色素 C（Cyt-c），凋亡酶激活因子（Apaf-1）與Cytochrome-C形成復(fù)合物，加速Caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，Caspase-3經(jīng)切割后的Caspase-9激活，導(dǎo)致細胞凋亡發(fā)生。Caspase-3是誘導(dǎo)凋亡的最終效應(yīng)蛋白，在凋亡途徑中扮演重要角色。Bcl-2家族中抗凋亡蛋白（Bcl-2）與促凋亡蛋白（Bax）在體內(nèi)的比例處于動態(tài)變化中，調(diào)節(jié)線粒體膜通透性，從而進一步調(diào)控細胞凋亡。下調(diào)抗凋亡蛋白（Bcl-2）或上調(diào)促凋亡蛋白（Bax）導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，使細胞色素c釋放，并進入胞質(zhì)，激活Caspase-3[13-14]。PI3K/AKT信號途徑可參與調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移、凋亡等途徑，并在MCAO/R損傷中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[15-17]。

課題組前期研究表明，水蛭和地龍?zhí)崛∫壕哂休^好的腦保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，通過應(yīng)用水蛭及地龍干預(yù)小鼠腦缺血再灌注損傷，改善MCAO/R小鼠腦缺血半暗帶神經(jīng)元損傷，減少受損尼氏體數(shù)目，上調(diào)腦缺血半暗帶NeuN、MAP2蛋白表達水平，降低神經(jīng)元凋亡率，降低Cleaved Caspase-3/Caspase-3相對蛋白表達水平，上調(diào)Bcl-2/Bax相對蛋白表達水平，上調(diào)PI3K、p-AKT/AKT相對蛋白表達，激活PI3K/AKT信號通路。水蛭和地龍?zhí)崛∫撼煞謴?fù)雜，水蛭提取液中主要是水蛭素，地龍?zhí)崛∫褐兄饕球炯っ福瑫r兩者中還含有一定多肽類成分和谷氨酸等。對于上述指標(biāo)，水蛭和地龍都表現(xiàn)出很好的藥理作用，但在Cleaved Caspase-3和PI3K等相關(guān)指標(biāo)上水蛭和地龍作用趨勢存在差異，表明水蛭和地龍對腦缺血再灌注后神經(jīng)元保護作用有不同側(cè)重。在臨床上，由水蛭和地龍組成的疏血通注射液在缺血性腦卒中方面已有較廣泛應(yīng)用[18]。本研究分別考察水蛭、地龍?zhí)崛∥飭为殤?yīng)用對MCAO/R小鼠腦缺血半暗帶神經(jīng)元的保護作用，為進一步研究各自在發(fā)揮神經(jīng)保護作用方面的特定靶點，探討疏血通注射液對腦缺血再灌注后神經(jīng)元的保護作用奠定了實驗基礎(chǔ)。