紅三葉葉蛋白浸提和絮凝條件的研究

李榮杰 劉信寶

（1.常州市動物疫病預防控制中心，江蘇常州 213000； 2.南京農業大學草業學院，江蘇南京 210095）

葉蛋白是將新鮮的植物莖葉粉碎打漿、水或酸（堿）溶液浸提、絮凝分離而提取出來的蛋白質。葉蛋白除含有18種氨基酸外，還含有糖、脂肪、多種維生素以及鐵、鎂、鈣、鋅、銅等多種礦物元素，是優質的蛋白質飼料。葉蛋白提取之后的草渣、草粉加工后可以添加為作為反芻動物的飼料，或者用做青貯原料；絮凝分離之后剩余的上清液可以提取超氧化歧化酶，也可以用于微生物培養或者直接用于畜禽養殖。因此，葉蛋白生產不僅可以為畜牧業提供優質的蛋白質飼料，還可以提高植物的利用效率，在生產上具有很好的發展前景。

葉蛋白生產受生產原料的蛋白質含量、原料粉碎后的浸提技術以及浸提液中蛋白質的絮凝技術等3個方面影響。牧草是生產葉蛋白的優質原料，資源豐富，產量高，尤其是豆科牧草，蛋白質含量高，提取容易。葉蛋白的浸提技術受浸提液料液比、浸提溫度和浸提時間3個關鍵環節的影響，而絮凝技術受加熱溫度和加熱時間2個關鍵環節的影響。

本研究選擇優質豆科牧草紅三葉作為試驗材料，采用單因素和正交實驗研究了料液比、浸提溫度和浸提時間對葉蛋白浸出率的影響，確定紅三葉葉蛋白浸提的適宜條件；在適宜的浸提條件下，通過測定在不同加熱溫度和加熱時間條件下紅三葉葉蛋白的絮凝率，確定適宜的絮凝條件。通過紅三葉葉蛋白浸提和絮凝條件的研究，為葉蛋白生產提供理論依據，促進畜牧業穩定可持續發展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅三葉種子由湖北農科院畜牧所提供，于南京農業大學牌樓教學實驗基地種植，現蕾期刈割作為試驗材料。

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 浸提液制備

按一定的料液比稱取新鮮紅三葉，加適量的水，用打漿機打碎后按照不同的浸提溫度和時間在恒溫水浴鍋中浸提，達到預定時間后取出，紗布（3層）過濾。濾液于4℃、10000r/min條件下離心10min，得到上清液后測定其中蛋白質的含量，計算葉蛋白提取率。

1.2.2 單因素試驗

浸提液制備：分別以料液比為1：10、1：15、1：20、1：25和1：30，浸提時間為20、30、40、50和60min，浸提溫度為30、35、40、45和50℃進行單因素實驗，測定葉蛋白含量，計算不同條件下的葉蛋白提取率。

1.2.3 正交試驗

根據單因素試驗結果，確定適宜的料液比、浸提時間、浸提溫度，進行3因素3水平正交試驗，通過測定不同處理條件下的葉蛋白含量，篩選出紅三葉最佳提取條件，確定影響葉蛋白提取率不同因素的重要程度。

1.3 蛋白質含量測定

考馬斯亮藍法。

1.4 數據統計與分析

Excel整理數據，SPSS20.0進行統計分析。

2 結果與分析

紅三葉葉蛋白單因素提?。?/p>

2.1 稀釋倍數

在浸提溫度為40℃，分別稀釋10、15、20、25和30倍，浸提40min制備紅三葉浸提液，測定蛋白質含量，計算葉蛋白提取率。

結果表明，在固定的提取溫度和提取時間時，紅三葉稀釋25倍葉蛋白提取率最高，達3.02%；稀釋10倍葉蛋白提取率最低，為2.19%。稀釋倍數小于25時，葉蛋白提取率隨著稀釋倍數增加而呈現升高趨勢；稀釋倍數大于25后，葉蛋白提取率呈現降低趨勢。

2.2 浸提時間

在浸提溫度為40℃，稀釋20倍，浸提時間分別為20、30、40、50和60min條件下制備紅三葉浸提液，測定浸提液蛋白質含量，計算葉蛋白提取率，結果如圖1。

圖1 不同時間對葉蛋白提取率的影響

結果表明，在浸提溫度和稀釋倍數一定條件下，浸提率隨著浸提時間的延長呈現升高趨勢，浸提時間為40min時葉蛋白提取效果最高，達3.29%；浸提時間為20min時，浸提率最低，為2.22%。當浸提時間超過40min，浸提率又有所降低。

2.3 浸提溫度

在稀釋20倍，浸提溫度為30、35、40、45和50℃的條件下將紅三葉浸提40min，測定浸提液蛋白質含量，計算浸提率，結果如圖2。

圖2 不同溫度對葉蛋白提取率的影響

結果表明，紅三葉浸提率在35℃時最低，為2.49%；在40℃時最高，為3.72%。當溫度高于40℃時，葉蛋白提取率逐漸下降。這與蛋白酶活性在不同溫度條件下活性強弱有關，適宜溫度條件下，活性強，蛋白質分解較多；溫度過高使其活性下降，蛋白質分解較少。因而葉蛋白提取率有所降低。

2.4 紅三葉葉蛋白3因素正交實驗

根據稀釋倍數、浸提溫度和浸提時間實驗結果，在稀釋15、20和25倍，浸提30、40和50min，浸提溫度35、40和45℃條件下對紅三葉進行3因素3水平的正交實驗，實驗結果見表1。

表1 正交試驗結果

表1結果表明，3個因素對紅三提取率的影響程度大小依次為：稀釋倍數，浸提時間，浸提溫度。在40℃，稀釋20倍，浸提50min條件下紅三葉葉蛋白提取效果最好，提取率為3.59%。

2.5 紅三葉葉蛋白絮凝實驗

在由正交試驗得到的最佳提取條件下，通過測定不同絮凝溫度和不同加熱時間處理的葉蛋白產量，獲得紅三葉葉蛋白絮凝最佳的技術參數。

在同一絮凝時間條件下，隨著溫度升高，蛋白質絮凝效果存在差異。5min時，隨著時間的延長，蛋白質絮凝率有降低的趨勢，60和70℃處理顯著高于80和90℃處理。10min時，70℃處理顯著高于其它處理（p＜0.05）。15min時，70℃處理顯著高于其它處理（p＜0.05）。

實驗結果表明，蛋白質絮凝受虛擬時間和絮凝溫度的影響。70℃、10min和15min蛋白質絮凝效果最好，根據環保節能及成本考慮，在蛋白質絮凝環節，選擇70℃加熱10min為最佳。

3 討論

牧草葉蛋白生產對牧草生產和畜牧生產均具有重要的生產意義。葉蛋白生產受很多條件的影響，原料、浸提技術和絮凝技術是影響其生產性能的3個重要因素。本試驗以適宜調制葉蛋白的優質原料紅三葉為研究對象，從稀釋倍數，浸提溫度，浸提時間3個因素進行了浸提率的比較。在試驗結果的基礎上，篩選適宜的處理水平，通過3×3正交試驗設計，對紅三葉葉蛋白的浸提率進行了研究，并在確定浸提工藝的基礎上，研究了加熱溫度和加熱時間對葉蛋白絮凝的影響。

結果表明，紅三葉葉蛋白浸提率在不同處理下存在差異，其最適浸提條件為：浸提溫度為40℃稀釋倍數為20，40℃浸提時間50min效果最好，提取率為3.59%。影響紅三葉葉蛋白提取的因素大小程度為：稀釋倍數>浸提時間>浸提溫度。

葉蛋白絮凝試驗結果表明，紅三葉葉蛋白的最佳絮凝參數為70℃、10min。

在葉蛋白浸提過程中存在著蛋白質溶解及蛋白質降解兩個過程。浸提時間過短，蛋白質溶出較少，提取率降低；時間過長，蛋白質溶出雖然較多，但可能存在牧草體內蛋白酶作用增強，加快了蛋白質的降解。因此，適宜的浸提時間比較重要。

浸提溫度影響牧草體內蛋白酶的活性高低和蛋白質溶解量的多少。本研究結果也顯示出，浸提溫度對紅三葉的浸提率存在著影響，且影響程度存在差異。

實驗結果都表明，稀釋倍數是影響葉蛋白生產的最重要因素。稀釋倍數過低，蛋白質很容易達到飽和而溶解過少；稀釋倍數過高，加大了蛋白質與蛋白酶的結合程度，使蛋白質降解過多，導致效果不好，同時由于稀釋過高，增加了葉蛋白的下一步操作。因此，適宜的稀釋倍數對于葉蛋白生產來說相當重要。