羊布魯氏菌病不同血清學檢測方法的比較

李而珍 黃覺 李志賢 虞與理

（廣西賀州市動物疫病預防控制中心，廣西賀州 542899）

1 前言

羊布魯氏菌病又被稱為布病，它是由布魯氏菌引起的人畜共患的一種慢性傳染病，主要侵害生殖系統。羊感染后，以母羊發生流產和公羊發生睪丸炎為特征，主要有發熱、流產、睪丸炎癥、關節腫脹等癥狀。該病分布很廣，除了危害羊之外，不僅感染各種家畜，而且易傳染給人，危害人類的身體健康。為了更好的防范該種傳染性疾病的傳播流行，需要做好妥善的疫苗免疫接種工作和疫情的檢測篩查。在羊布魯氏桿菌病診斷過程中常用的檢測方法，主要包括了虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、競爭ELISA抗體檢測等。

某市對某羊場進行布病日常監測，采集了20份血液，檢出4份陽性。某市對該羊場進行了全場采樣，并通過對該羊場進行流行病學調查分析，對附近與該羊場有配種、放牧等接觸的21個羊場也進行了全場采樣，共采集新鮮血液1745份，將其放置在4℃的溫箱當中進行保存，在試驗操作過程中，首先對采集到的血液進行血清分離得到的血清進行編號處理（編號1-1745），然后進行血清學檢測，研究不同學清學檢測方法對布魯氏桿菌病的檢測效果。

2 虎紅平板凝集試驗

按照布魯氏桿菌診斷技術標準進行（GB/T18646-2002動物布魯氏菌病診斷技術 虎紅平板凝集試驗），在檢測過程中主要涉及到的試劑為虎紅平板凝集試驗抗原和陰陽性對照血清，在玻璃板上各格標記受檢血清號，然后加受檢血清30μL，在受檢血清旁滴加抗原30μL，用牙簽類小棒攪拌血清和抗原使之混合，同時做陰陽性對照血清，在4min內進行判定，在陰、陽性血清對照成立的條件下，對被檢血清進行判定，出現肉眼可見凝集現象者判為陽性（+），無凝集現象，呈均勻粉紅色者判為陰性（-）。經檢測1745份羊血清，103份為陽性，1642份為陰性。

3 試管凝集試驗

按照布魯氏桿菌診斷技術標準進行（GB/T18646-2018動物布魯氏菌病診斷技術 試管凝集試驗），在檢測過程中主要涉及到的試劑為布魯氏桿菌試管凝集試驗抗原和陰陽性對照血清、0.5%石炭酸的10%氯化鈉溶液，毎份血清用4支凝集試管，分別加入稀釋液、陰陽對照血清、受檢血清，從第1至第4管依次做稀釋，血清稀釋度分別為1：12.5、1：25、1：50、1：100，將稀釋好的抗原液500μL分別加人已稀釋好的各管血清中，羊血清稀釋度則依次變為1：25、1：50、1：100、1：200，并做抗原對照和參照比濁管，將加樣后的試管置溫箱（37℃±1℃）孵育18～24h。

凝集反應程度應根據參照比獨管來判讀，分別記為“++++” “+++”“++”“+”“-”。++++菌體完全凝集，100%下沉，上層液體100%清亮；+++菌休幾乎完全凝集，上層液體75%清亮；++菌體凝集顯著，液體50%清亮；+有凝集物沉淀，液體25%清亮；-無凝集物，液體均勻混濁。當陽性對照血清出現完全凝集（++++），陰性對照血清無凝集（一），抗原對照無自凝（一）現象時，試驗成立。結果判定：1：50血清稀釋度，出現“++”及以上凝集現象時，判定為陽性，1：25血清稀釋度，出現“++”以上凝集現象時，判定為可疑。將虎紅平板凝集試驗篩選出的103份陽性血清進行試驗，如下表（其中10份）：

經判定76份血清在1：50血清稀釋度，出現“++”及以上凝集現象，判定為陽性；21份血清在1：25血清稀釋度，出現“++” 以上凝集現象，判定為可疑；6份判定為陰性。

4 競爭ELISA抗體檢測

按照羊布魯氏菌病抗體檢測試劑盒（EILSA）中的相關說明進行嚴格的操作，在檢測過程中主要涉及到的試劑為布魯氏菌競爭抗體、酶標抗體、布魯氏菌陰陽性對照血清、底物溶液、終止液等，每孔加入40uL工作濃度的洗滌液，分別在對應孔中加入陰陽性對照血清和受檢血清，每孔加入50uL的競爭抗體混勻，37℃孵育60min，拿出抗原包被板甩干孔中的液體，每孔加入300ul工作濃度的洗滌液，洗滌3次，拍干后每孔加入100uL的酶標抗體，37℃孵育30min，按上步驟再次洗滌后，每孔加入50uL底物溶液A，再加入50uL底物溶液B，37℃避光孵育10～15min，每孔加入50uL的終止液終止顯色反應，使用酶標儀測定450nm波長處的OD值。將虎紅平板凝集試驗篩選出的103份陽性血清進行試驗，經檢測103份血清的OD值，如下表：

結果判定：陰陽性血清和受檢樣品的平均OD值分別為ODNC、ODPC、ODS，陽性血清抑制率=（ODNC-ODPC）/ODNCx100%，樣品抑制率=（ODNC-ODS）/ ODNCx100%。ODNC值應>0.5且陽性血清抑制率應>60%，試驗結果有效，否則重新進行試驗。樣品抑制率≥50%判為陽性，樣品抑制率<50%判為陰性。經計算陽性血清抑制率為89.9%（表1）、89.5%（表2），試驗結果有效，對103份受檢樣品進行計算，102份為陽性，1份為陰性。

表1

表2

5 討論

三種試驗檢測結果統計，如下圖：

以上三種試驗在操作過程中，不同的試驗有著不同的診斷技術操作標準，檢測的精確性也存在一定差異，同時也存在人為對試劑配制和操作的因素，特別是試管凝集試驗在操作過程中相對比較復雜，整個試驗過程相對較長，在進行結果判定過程中很容易受到相關人員的主觀因素影響而出現較大的誤差。在試驗操作過程中應按照診斷技術標準進行嚴格的操作。

虎紅平板凝集試驗主要是快速凝集反應，更適合流行病學的篩查，用于檢測動物是否感染布魯氏菌病。試管凝集試驗和競爭ELISA抗體檢測，主要應用于感染動物的臨床診斷及布魯氏菌病的確診診斷。試管凝集試驗，用時較長，操作相對較復雜，結果可疑的家畜還需經30d后采血重檢，但是凝集試驗除了判定陰陽性，還能判定血清的抗體滴度。競爭ELISA抗體檢測，是一種特異性較強的檢測手段，并且靈敏度較高，操作較為簡單，一次性能夠完成大量樣本的檢測。診斷布魯氏菌病的標準是找到病原體，但是布魯氏菌的血培養或者骨髓培養的陽性率是有限的，更多依賴的就是免疫學方面的檢測。在進行布魯氏菌病抗體檢測過程中，三種試驗都是當前階段采用的方法，每種方法各有優缺點和適用性，通過實驗檢測，一般還要結合患者的流行病學病史來綜合考慮是否患有布魯氏菌病。