微小RNA-152-3p對結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其作用機制研究

王磊，鄭廣濤

結腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，因其早期病癥隱匿，部分病人發現時已出現肝臟轉移，化療是其重要治療方法。然而，化療具有一定局限性，而分子靶向藥物治療可以能夠特異性阻止結腸癌細胞增殖并不損傷正常細胞，可延長結腸癌病人的生存期，提高病人的生命質量［1］。微小RNA（miRNA，miR）是由20 個左右核苷酸組成的內源性單鏈RNA小分子，許多研究表明多種miRNA的異常表達與結腸癌的進展關系密切［2］。有研究報道miR-152-3p 能抑制人胃癌SGC-7901 細胞增殖并誘導細胞凋亡［3］；上調miR-152 可逆轉膀胱癌細胞EMT，從而降低膀胱癌生長、侵襲和遷移的風險［4］。miR-152在結直腸癌組織中的低表達，與結直腸癌病人的淋巴結轉移和TNM 分期有關［5］。轉移相關蛋白2（metastasis-associated gene2，MTA2）是MTA 家族重要成員之一，研究發現MTA2在結腸癌組織中表達較高，與腫瘤的臨床分期、分化程度等密切相關［6］。過表達MTA1 通過促進MTA2 降解在體外抑制乳腺癌ZR-75-30 細胞的轉移［7］。但miR-152-3p 對結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其作用機制是否與MTA1 相關尚未可知，本研究于2019 年2 月至2020年4月通過體外細胞實驗揭示miR-152-3p對結腸癌細胞的影響及其機制是否與MTA1有關。

1 材料與方法

1.1 材料結腸癌細胞LoVo、HCT116、SW480和人正常結腸上皮細胞NCM460，中國典型培養物保藏中心；熒光定量試劑、Trizol 試劑盒，美國Alpco 公司；RPMI-1640 培養基，美國Gibico 公司；噻唑藍（MTT）試劑盒，美國Sigma 公司；放射免疫沉淀法（RIPA）蛋白裂解液，南京凱基生物公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，碧云天。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組 以含胎牛血清的RPMI-1640 培養基培養結腸癌細胞HCT116、LoVo、SW480和人正常結腸上皮細胞NCM460；取對數生長期SW480 細胞，無血清培養后進行轉染，轉染分為miR-152-3p 模擬物陰性對照（miR-NC）組、miR-152-3p 模擬物（miR-152-3p）組、抑制物（anti-miR-NC）組、miR-152-3p 抑制物（anti-miR-152-3p）組、陰性對照（si-NC）組、沉默轉移相關蛋白2（si-MTA2）組、miR-152-3p 模 擬 物+ 空 載 體（miR-152-3p+pcDNA3.1）組、miR-152-3p 模擬物+過表達MTA2（miR-152-3p+pcDNA3.1-MTA2）組，另取未轉染結直腸癌SW480細胞記為Control組。

1.2.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測miR-152-3p 和MTA2 mRNA 表達水平提取細胞總RNA，逆轉錄為互補DNA（cDNA），定量，相對表達量以β肌動蛋白（β-actin）為內參。

1.2.3 蛋白質印跡法測定蛋白的表達 提取總蛋白，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，脫脂奶粉室溫封閉膜1 h，將膜至于稀釋的一抗溶液中4 ℃孵育過夜，再用稀釋的二抗室溫孵育膜2 h。顯影定影，對蛋白條帶進行吸光度分析，計算蛋白表達水平。

圖3 過表達miR-152-3p和沉默轉移相關蛋白2（MTA2）對結腸癌細胞SW480遷移和侵襲的影響（結晶紫染色×200）

1.2.4 MTT 法檢測細胞增殖 各組細胞均培養48 h，參照試劑盒指南，用酶標儀測490 nm處吸光度。

1.2.5 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲 遷移：Transwell上室加200 μL 懸液，下室加培養液，溫育24 h，甲醛、結晶紫固定染色后，顯微鏡下細胞計數。侵襲：Matrigel包被Transwell上室，其余步驟同遷移。

1.2.6 熒光素酶報告基因檢測實驗 構建MTA2 的3′非翻譯區（3′-UTR）野生型和突變型熒光素酶載體（MTA2-WT 和MTA2-MUT），將其分別與miR-NC及miR-152-3p 共轉染至SW480 細胞中；依報告指南測熒光素酶活性。

1.3 統計學方法采用SPSS 20.00 進行統計學分析。計量資料以± s表示，兩組間比較行兩獨立樣本t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步多組間的兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-152-3p 在結腸癌細胞中表達下調，MTA2表達上調與正常結腸上皮細胞NCM460 相比，結腸癌細胞HCT116、LoVo、SW480 中MTA2 mRNA 和蛋白較高，miR-152-3p 較低（P＜0.05），選擇MTA2 和miR-152-3p 表達較NCM460 細胞差異最明顯的結腸癌SW480進行后續實驗。見圖1，表1。

圖1 人正常結腸上皮細胞NCM460與結腸癌細胞LoVo、HCT116、SW480中MTA2蛋白表達

表1 人正常結腸上皮細胞NCM460與結腸癌細胞LoVo、HCT116、SW480中miR-152-3p和MTA2表達水平比較/± s

表1 人正常結腸上皮細胞NCM460與結腸癌細胞LoVo、HCT116、SW480中miR-152-3p和MTA2表達水平比較/± s

注：MTA2為轉移相關蛋白2。①相比NCM460 細胞，P＜0.05。②相比HCT116 細胞，P＜0.05。③相比SW480細胞，P＜0.05。

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2.2 過表達miR-152-3p和沉默MTA2對SW480細胞增殖的影響轉染miR-152-3p mimics 的SW480細胞中miR-152-3p 表達水平顯著高于轉染miR-NC的細胞（3.53±0.12 比1.03±0.05，t=33.31，P＜0.05），轉染si-MTA2 的SW480 細胞中MTA2 蛋白表達顯著低于 轉 染si-NC 的 細 胞（0.33±0.03 比0.99±0.08，t=13.39，P＜0.05），說 明 過 表 達miR-152-3p 或 沉 默MTA2的SW480細胞構建成功。

與miR-NC 組 相 比，miR-152-3p 組SW480 細 胞中細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、SW480 細胞活性較低，周期素依賴激酶抑制劑p21（P21）較高（P＜0.05）；與si-NC組相比，si-MTA2組SW480細胞中cyclin D1表達較低，P21表達較高，SW480細胞活性較低（P＜0.05）。見圖2，表2。

2.3 過表達miR-152-3p和沉默MTA2對SW480細胞遷移和侵襲的影響與miR-NC組相比，miR-152-3p 組SW480 細胞中上皮鈣黏素（E-cadherin）較高，基質金屬蛋白酶（MMP）-2 較低，SW480 細胞遷移和侵襲數量較低（P＜0.05）；與si-NC 組相比，si-MTA2組SW480 細胞中MMP-2 表達較低，E-cadherin 表達較高，SW480 細胞遷移和侵襲數量顯著降低（P＜0.05）。見圖3，4；表3。

表2 過表達miR-152-3p或沉默MTA2對結腸癌細胞SW480增殖的影響/± s

表2 過表達miR-152-3p或沉默MTA2對結腸癌細胞SW480增殖的影響/± s

注：MTA2 為轉移相關蛋白2，cyclin D1 為細胞周期蛋白D1，P21為周期素依賴激酶抑制劑p21。①相比Control 組，P＜0.05。②相比miR-NC 組，P＜0.05。③相比si-NC組，P＜0.05。

組別Control miR-NC miR-152-3p si-NC si-MTA2 F值P值重復次數33 3 3 3吸光度0.92±0.22 0.96±0.17 0.31±0.07①②0.99±0.17 0.32±0.09①③15.62＜0.001 cyclin D1蛋白0.85±0.07 0.87±0.09 0.36±0.03①②0.91±0.12 0.26±0.083①③42.39＜0.001 P21蛋白0.34±0.03 0.36±0.04 0.65±0.09①②0.25±0.04 0.89±0.18①③23.73＜0.001

圖4 過表達miR-152-3p和沉默MTA2對結腸癌細胞SW480中MMP-2和E-cadherin蛋白表達表達的影響

2.4 miR-152-3p靶向調控MTA2表達TargetScan數據庫分析顯示MTA2 與miR-152-3p 存在結合位點；miR-152-3p 與MTA2-WT 共轉染的SW480 細胞熒光素酶活性降低（0.43±0.03 比1.10±0.15，t=7.59，P=0.002）；而miR-152-3p 與MTA2-MUT 共 轉 染 的SW480 細胞的熒光素酶活性差異無統計學意義（0.92±0.09 比1.13±0.14，t=2.19，P=0.094）。過表達miR-152-3p，MTA2 表達水平顯著降低；抑制miR-152-3p 表達，MTA2 表達水平顯著升高（P＜0.05）。見表4。

表4 miR-152-3p對MTA2 mRNA和蛋白表達的影響/± s

表4 miR-152-3p對MTA2 mRNA和蛋白表達的影響/± s

組別miR-NC miR-152-3p anti-miR-NC anti-miR-152-3p F值P值重復次數3 3 3 3 MTA2 mRNA 0.99±0.03 0.23±0.02①0.98±0.02 3.61±0.10②2 251.79＜0.001 MTA2蛋白0.92±0.09 0.40±0.02①0.92±0.11 1.78±0.18②74.05＜0.001

注：MTA2為轉移相關蛋白2。
①相比miR-NC組，P＜0.05。②相比anti-miR-NC組，P＜0.05。

2.5 過表達MTA2 逆轉過表達miR-152-3p 對結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用相比miR-152-3p+pcDNA3.1 組，miR-152-3p+pcDNA3.1-MTA2組SW480 細胞中P21、E-cadherin 的表達較低，MTA2、cyclin D1、MMP-2蛋白的表達較高，SW480細胞活性、遷移、侵襲數量較高（P＜0.05），見表5。

3 討論

結腸癌發病率和病死率均較高，對人類健康危害極大，分子靶向治療是一種新的方法，已取得一些成果，但仍有待深入研究［8-9］。miR-152 在多種腫瘤中可作為一種腫瘤抑制因子，如miR-152-3p 在膠質瘤細胞中低表達，過表達miR-152-3p 顯著誘導細胞凋亡并抑制侵襲活性［10］。miR-152-3p 還能抑制前列腺癌細胞活力和侵襲潛力［11］；上調miR-152-3p表達可抑制心肌細胞凋亡［12］。本研究顯示，miR-152-3p 在結腸癌細胞低表達，miR-152-3p 過表達對SW480細胞增殖遷移及侵襲起抑制作用。

MTA2 轉移相關基因，在腫瘤中多作為致癌基因，可作為診斷和治療腫瘤的靶點。下調MTA2 的表達抑制了胃癌的侵襲及轉移［13］；穩定干擾MTA2有效抑制了乳腺癌的增殖、轉移［14］。MTA2 在結腸癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織，與腫瘤的分化程度、臨床分期、淋巴結轉移有關，提示MTA2 與結腸癌惡性程度有關，對結腸癌的侵襲轉移起促進作用，參與結腸癌的發展過程［15］。本實驗結果同樣表明，MTA2 在結腸癌細胞高表達，沉默MTA2 能抑制SW480 細胞增殖、遷移和侵襲。且miR-152-3p 靶向調控MTA2，過表達MTA2 逆轉了miR-152-3p 對SW480細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。

E-cadherin 是上皮屏障和侵襲抑制因子，其下調表達會導致上皮細胞去分化和高度浸潤從而有利于腫瘤細胞的侵襲轉移；MMP 是一種蛋白水解酶，MMP-2 是其家族的一員，與結腸癌的侵襲轉移相關［16-17］。本研究結果顯示，過表達miR-152-3p 和沉默MTA2 對MMP-2 表達起抑制作用，對E-cadherin 表達起促進作用，提示其可抑制結腸癌侵襲轉移。cyclin D1 是細胞周期正調控因子，高表達促進細胞增殖，P21 是細胞周期的負調控因子，促進p21表達，進而抑制cyclin D1 表達，可抑制結腸癌細胞增殖［18-19］。本研究結果顯示，過表達miR-152-3p 和沉默MTA2 抑制了cyclin D1 的表達，促進了P21 的表達，表明其可抑制結腸癌的惡性增殖。

綜上，miR-152-3p 能抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其機制可能與MTA2有關。

表3 過表達miR-152-3p和沉默MTA2對結腸癌細胞SW480遷移、侵襲及MMP-2和E-cadherin蛋白表達的影響/± s

表3 過表達miR-152-3p和沉默MTA2對結腸癌細胞SW480遷移、侵襲及MMP-2和E-cadherin蛋白表達的影響/± s

注：MTA2為轉移相關蛋白2，MMP-2為基質金屬蛋白酶-2，E-cadherin為上皮鈣黏素。①相比Control組，P＜0.05。②相比miR-NC組，P＜0.05。③相比si-NC組，P＜0.05。

組別Control miR-NC miR-152-3p si-NC si-MTA2 F值P值重復次數33333細胞遷移數/個172.00±23.52 169.00±20.66 53.67±12.22①②155.67±16.8 54.33±8.74①③38.02＜0.001細胞侵襲數/個124.67±10.02 122.33±9.45 26.00±5.00①②108.33±10.02 42.00±4.00①③100.13＜0.001 MMP-2蛋白0.92±0.09 0.96±0.10 0.47±0.04①②0.98±0.18 0.31±0.03①③27.98＜0.001 E-cadherin蛋白0.43±0.03 0.48±0.03 1.09±0.16①②0.32±0.06 1.30±0.14①③57.43＜0.001

表5 過表達MTA2逆轉miR-152-3p對結腸癌細胞SW480增殖、遷移和侵襲及相關蛋白表達的影響/± s

表5 過表達MTA2逆轉miR-152-3p對結腸癌細胞SW480增殖、遷移和侵襲及相關蛋白表達的影響/± s

注：MTA2為轉移相關蛋白2，cyclin D1為細胞周期蛋白D1，P21為周期素依賴激酶抑制劑p21，MMP-2為基質金屬蛋白酶-2，E-cadherin 為上皮鈣黏素。

組別miR-152-3p+pcDNA3.1 miR-152-3p+pcDNA3.1-MTA2 t值P值重復次數33吸光度0.35±0.07 0.69±0.15 3.56 0.024細胞遷移數/個56.67±7.09 139.33±19.04 7.05 0.002細胞侵襲數/個40.00±5.29 117.67±10.6 11.36＜0.001 MTA2蛋白0.43±0.06 0.99±0.14 6.37＜0.001 cyclin D1蛋白0.42±0.06 1.35±0.07 17.47＜0.001 P21蛋白1.13±0.11 0.46±0.06 9.26 0.001 MMP-2蛋白0.64±0.04 1.9±0.24 8.97 0.001 E-cadherin蛋白1.86±0.13 0.65±0.04 15.41＜0.001

（本文圖3見插圖9-4）