乳腺癌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)與人乳頭狀瘤病毒16/18感染的關(guān)系及其臨床病理意義

梅娟，馬新義，張金蓮，張正

乳腺癌是一種臨床常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增加，但其病因尚未完全闡明。既往研究認(rèn)為家族病史、生活方式等均為該病致病因素［1］。早期診斷乳腺癌對(duì)提高病人治療及改善病人預(yù)后均有重要意義［2］。進(jìn)一步探討影響乳腺癌可能發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制及尋找分子標(biāo)志物對(duì)提高臨床早期診療效果具有重要應(yīng)用價(jià)值。乳腺癌屬血管依賴性病變，多種因素參與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲過(guò)程。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）可降解細(xì)胞外基質(zhì)及基膜進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移或侵襲。MMP-2、MMP-9 與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、遷移及侵襲的作用關(guān)系密切。MMP-9在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，并可參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展，可作為評(píng)估乳腺癌疾病進(jìn)展的重要生物學(xué)標(biāo)志物［3-4］。近年來(lái)研究顯示，感染人乳頭狀瘤病毒（HPV）16/18 型可在E7 蛋白的黏膜和表皮膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，并增強(qiáng)MMP 表達(dá)及活性，HPV16/18 型感染還與乳腺癌等其他臟器上皮腫瘤密切相關(guān)［5］。但是，乳腺癌病人中MMP-2、MMP-9 表達(dá)與HPV16/18感染的相關(guān)性研究相對(duì)較少。本研究擬通過(guò)檢測(cè)乳腺癌病人癌組織中MMP-2、MMP-9 表達(dá)及HPV16/18 感染情況，初步分析MMP-2、MMP-9 表達(dá)與HPV16/18 感染的關(guān)系，為臨床治療及預(yù)防乳腺癌病人HPV16/18 感染提供理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性選取2015 年3 月至2018 年5月蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的90例乳腺癌病人為研究對(duì)象，乳腺癌病人行外科手術(shù)切除的標(biāo)本為乳腺癌組，所有病人均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。收集90 例乳腺癌病人臨床病理資料，包括腫瘤長(zhǎng)徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、絕經(jīng)狀態(tài)、雌激素受體（ER）表達(dá)情況等。乳腺癌組病人年齡（52.16±5.24）歲，范圍為45～70歲。同時(shí)選取同期該院85 例因良性疾病切除病變周圍正常乳腺組織為對(duì)照組，病人年齡（51.57±4.65）歲，范圍為43～72歲。兩組年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：乳腺癌活組織檢查前均未進(jìn)行放療或化療；生存時(shí)間超過(guò)6 個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤者；患有自身免疫性疾病者；臨床資料不全者。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

圖1 基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2與MMP-9在乳腺正常組織和乳腺癌組織中的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色×400）

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)乳腺癌組織中MMP-2、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平 取出凍存乳腺癌及正常乳腺組織樣本，按照Trizol 試劑盒（日本TaKaRa 公司）說(shuō)明書(shū)操作提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。根據(jù)SYBR Green RCR master mix 試劑（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司）加樣。反應(yīng)體系（20 μL）：SYBR Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μL，cDNA 樣本2.0 μL，正反向引物各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。熒光定量PCR 儀（西安天隆科技有限公司）程序：95 ℃1 min；95 ℃30 s、60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。MMP-2、MMP-9 均以β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參基因。β-actin 5’-3’正向引物GTCGGTGAATGAAGTGCTTA，反向引物GCTTCGGGTAAGTTTGCCGG；MMP-2 5’-3’正向引物 ATTTTCCCCTCGACAGCCTC， 反 向 引 物GTCCCAGGCGTAGACCAATA；MMP-9 5’-3’正向引物AATATCAGACATTCGGGAGG，反向引物GTCAATGTACAGCTGCCCCA。采用2-ΔΔCt法計(jì)算MMP-2、MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá) 乳腺癌及正常乳腺組織采用石蠟包埋制作石蠟切片（厚4 μm），脫蠟后置于甲醇溶液（含3%過(guò)氧化氫溶液）中，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗，放入乙二胺四乙酸（EDTA）緩沖液內(nèi)（pH 8.00，95 ℃，10 min），室溫冷卻20 min，兔血清室溫封閉切片，15 min 后去除多余液體，分別將一抗MMP-2（山羊抗人）、MMP-9（山羊抗人）均1∶200 分別滴加入切片，置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜，次日用PBS 沖洗，滴加二抗（兔抗山羊），室溫孵育20 min，PBS 沖洗，滴加DAB 進(jìn)行顯色反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇、二甲苯脫水透明，中性樹(shù)脂封片，置于顯微鏡下觀察。結(jié)果判定［6］：隨機(jī)選取400倍鏡下5個(gè)視野觀察細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，（1）根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占觀察細(xì)胞總數(shù)百分比分為＜5%（1 分）、5%～25%（2 分）、＞25%～50%（3 分）、＞50%～75%（4 分）、＞75%（5 分）；（2）根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色程度積分為：淡棕黃色（1分）、棕黃色（2分）、棕褐色（3分）。由該院病理醫(yī)師閱片并將兩項(xiàng)積分乘積＞2分者判斷為陽(yáng)性表達(dá)，≤2分者判斷為陰性表達(dá)。

1.2.3 HPV16/18 感染檢測(cè) 采用原位雜交法對(duì)HPV16/18 DNA 檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自福建邁新公司，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取乳腺癌組織與正常乳腺組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋、切片，并進(jìn)行脫蠟水化、干燥處理，加入胃酶工作液37 ℃消化30 min，乙醇脫水、空氣干燥。滴加25 μL HPV16/18 型DNA 探針，95 ℃原位雜交加熱器上變性8 min，37 ℃濕盒孵育過(guò)夜，TBS 緩沖液清洗，每張切片中滴加50 μL 抗地高辛抗體，37 ℃濕盒孵育30 min 后加入二抗，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染。同時(shí)采用已知的HPV16/18DNA 陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照，以TBS 液替代探針作陰性對(duì)照［7］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用軟件SPSS 22.0 分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以± s 表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)水平比較乳腺癌組病人MMP-2 mRNA（1.58±0.13）、MMP-9 mRNA（2.14±0.11）表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照 組（1.00±0.05、1.02±0.07）（t=38.53、79.83，均P＜0.001）。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示MMP-2與MMP-9陽(yáng)性信號(hào)位于細(xì)胞質(zhì)中，染色呈淺黃色、棕黃色、棕褐色，見(jiàn)圖1。乳腺癌組MMP-2 與MMP-9 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)兩組基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2與MMP-9蛋白表達(dá)結(jié)果/例（%）

2.3 HPV16/18-DNA 檢測(cè)結(jié)果乳腺癌組HPV16/18-DNA 陽(yáng)性率71.11%（64/90）顯著高于對(duì)照組12.94%（11/85）（χ2=60.40，P＜0.001）。

2.4 HPV16/18 感染、MMP-2、MMP-9 表達(dá)與乳腺癌病人臨床病理特征的關(guān)系觀察MMP-2、MMP-9表達(dá)及HPV16/18 感染與否與乳腺癌病人臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示MMP-2、MMP-9 表達(dá)及HPV16/18 感染與否均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、絕經(jīng)狀態(tài)、ER 陽(yáng)性明顯相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.5 乳腺癌MMP-2、MMP-9 表達(dá)與HPV16/18 感染的關(guān)系62 例MMP-2 陽(yáng)性表達(dá)病人同時(shí)HPV16/18-DNA 呈 陽(yáng) 性，61 例MMP-9 陽(yáng) 性 表 達(dá) 病 人 同 時(shí)HPV16/18-DNA 呈 陽(yáng) 性，MMP-2、MMP-9 表 達(dá) 與HPV16/18 感染存在明顯相關(guān)性（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義見(jiàn)表3。

3 討論

癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲是導(dǎo)致乳腺癌病人死亡的重要原因。研究顯示，腫瘤細(xì)胞移向血管壁并附著于血管壁或貼壁血栓，進(jìn)而促使腫瘤細(xì)胞增殖及浸潤(rùn)［8］。

HPV是一組雙鏈DNA病毒，乳腺癌組織中HPV高表達(dá)，HPV 可參與乳腺癌發(fā)生過(guò)程［9］。HPV E6和E7癌蛋白具有鋅指結(jié)構(gòu)域，二者在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和維持轉(zhuǎn)化組織惡性表達(dá)起重要作用。有研究顯示，HPV 致癌機(jī)制一般認(rèn)為與HPV DNA 整合有關(guān)，HPV E6 蛋白可通過(guò)E6 相關(guān)蛋白與P53 結(jié)合，達(dá)到抑制P53 蛋白與DNA 特異性位點(diǎn)結(jié)合，同時(shí)，也可導(dǎo)致已結(jié)合的P53 蛋白從DNA 上解除，并促使P53蛋白經(jīng)過(guò)泛素介導(dǎo)途徑而降解，最終造成細(xì)胞增殖失控及細(xì)胞凋亡機(jī)制缺陷，導(dǎo)致細(xì)胞永生化現(xiàn)象［10］。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組HPV16/18-DNA 陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組，提示HPV16/18-DNA 陽(yáng)性組乳腺癌發(fā)生率升高，乳腺癌發(fā)生可能與HPV感染相關(guān)。

表3 乳腺癌90例MMP-2、MMP-9表達(dá)與HPV16/18感染的關(guān)系/例

表2 HPV16/18感染、MMP-2、MMP-9表達(dá)與乳腺癌90例臨床病理特征的關(guān)系/例（%）

MMP-2 是一種Ⅳ型膠原酶并可降解基底膜骨架成分，進(jìn)而參與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲過(guò)程。研究顯示乳腺癌腫瘤細(xì)胞中MMP-2 呈高表達(dá)并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期密切相關(guān)［11］。MMP-9 是促進(jìn)細(xì)胞基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要酶，可參與乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，并可作為判斷乳腺癌浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)指標(biāo)；同時(shí)，MMP-9 還可通過(guò)上調(diào)血管生成因子表達(dá)水平，進(jìn)而誘導(dǎo)血管生成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及遷移［12］。研究表明，Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌病人中MMP-2、MMP-9 呈高表達(dá)，并與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D 呈明顯正相關(guān)，臨床上可通過(guò)抑制MMP-2、MMP-9 表達(dá)進(jìn)而治療乳腺癌，即MMP-2 與MMP-9 可能作為臨床治療乳腺癌的靶標(biāo)基因［13］。MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平與乳腺癌病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并可通過(guò)促進(jìn)淋巴管生成進(jìn)而促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［14］。與上述報(bào)道相似，本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組MMP-2、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，免疫組織化學(xué)顯示乳腺癌組MMP-2與MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常組，提示MMP-2、MMP-9 可能與乳腺癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。另外本研究結(jié)果還顯示，MMP-2、MMP-9 表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、絕經(jīng)狀態(tài)、ER陽(yáng)性明顯相關(guān)，隨著病人淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移及臨床分期的增加，MMP-2、MMP-9 陽(yáng)性表達(dá)均明顯高于陰性表達(dá)，提示MMP-2、MMP-9高表達(dá)可能參與乳腺癌發(fā)展過(guò)程。

有報(bào)道顯示，子宮頸癌組織中HPV 感染與MMP-7、MMP-9 表達(dá)密切相關(guān)，并與病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)相關(guān)［15］。另外，郭真真等［16］研究顯示，MCF-7-E6 細(xì)胞和MCF-7-E7 細(xì)胞中MMP-9 蛋白表達(dá)水平明顯高于MCF-7 親本細(xì)胞與MCF-7-Vect 細(xì)胞，認(rèn)為MMP-9 是降解Ⅳ型膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的主要酶系。在乳腺癌中，HPV16 E6 和E7 可能通過(guò)促進(jìn)MMP-9 的表達(dá)參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究比較乳腺癌MMP-2、MMP-9 表達(dá)與HPV16/18感染的關(guān)系，結(jié)果顯示MMP-2、MMP-9與HPV16/18-DNA 呈顯著相關(guān)性，說(shuō)明MMP-2、MMP-9 表達(dá)與HPV16/18 感染存在明顯相關(guān)性。提示MMP-2、MMP-9 表達(dá)及HPV16/18 陽(yáng)性可增加乳腺癌發(fā)生發(fā)展概率。關(guān)于MMP-2、MMP-9 與HPV16/18 陽(yáng)性的內(nèi)在分子關(guān)系目前尚不完全明確，有待進(jìn)一步深入研究。

本研究表明，乳腺癌組織中MMP-2、MMP-9 呈高表達(dá)，其表達(dá)與HPV16/18正相關(guān)，推測(cè)HPV16/18影響癌組織中MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，加重疾病進(jìn)程。但本研究尚未排除乳腺癌病人機(jī)會(huì)性感染HPV16/18 情況，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量繼續(xù)研究HPV16/18 感染、MMP-2、MMP-9 表達(dá)與乳腺癌的關(guān)系，以期揭示病毒對(duì)腫瘤發(fā)生及發(fā)展的影響。

（本文圖1見(jiàn)插圖9-3）