復方苦參注射液通過增強細胞免疫殺傷作用誘導宮頸癌海拉細胞凋亡

高愛春

宮頸癌是全球女性中第3 個常見的惡性腫瘤， 僅次于乳腺癌和結直腸癌，也是癌癥死亡的第4 大原因［1］。目前由于晚期診斷，宮頸癌病人的預后仍然不能令人滿意［2］。因此，對于宮頸癌迫切需要尋找新的治療策略。隨著生物療法的提出及應用，在癌癥治療上取得了一定的進展。生物療法又稱細胞免疫療法，是利用無毒副作用的天然物質，一方面直接抑制癌細胞增殖，阻止腫瘤的生長；另一方面，激活大量的免疫細胞，靶向攻擊腫瘤細胞，誘導腫瘤細胞凋亡，最終達到治療腫瘤的目的［3］。復方苦參注射液是一種具有廣譜抗腫瘤的、廣泛應用于臨床的中藥制劑，目前研究顯示，其可減輕宮頸癌病人放化療的毒副作用［4］。復方苦參注射液能夠直接殺傷腫瘤細胞，而且能夠增強機體免疫功能，對宮頸癌等惡性腫瘤的治療具有良好的應用前景［5-6］。但復方苦參注射液對宮頸癌細胞凋亡的研究目前鮮有報道。人白細胞抗原G（HLA-G）由人白細胞抗原（HLA）家族基因編碼，目前多項研究證實，HLA-G在多種惡性腫瘤中異常表達，與病人的預后不良和對免疫療法的抗性相關［7-9］。HLA-G 基因的過表達能夠促進宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移，阻礙細胞凋亡，促進宮頸癌進展［10］。因此本實驗于2018 年7月至2019 年8 月以復方苦參注射液處理人宮頸癌海拉細胞，探討其對海拉細胞凋亡的影響以及對HLA-G基因表達調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料人宮頸癌海拉細胞（美國ATCC 公司）；RPMI-1640 培養基、胰蛋白酶（美國HyClone 公司）；復方苦參注射液（山西振東集團金晶制藥有限公司）；人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）試劑（美國Sigma 公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；Trizol 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR 檢測試劑盒（日本TaKaRa 公司）；凋亡檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國Abcam 公司）；電化學發光法（ECL）檢測試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）；轉化生長因子β1（TGF-β1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-4（IL-4）試劑盒（北京雅安達生物技術有限公司）；B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）抗體、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）抗體、活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）抗體、HLA-G 抗體和二抗（美國CST公司）。

1.2 細胞培養人宮頸癌海拉細胞接種于含10%胎牛血清RPMI-1640 培養基的培養瓶中，置5%二氧化碳、37 ℃培養箱中培養，每天觀察細胞生長狀態，及時更換新鮮的培養基，待細胞生長密度達90%時，將細胞用0.25%的胰蛋白酶消化，進行傳達培養，取對數生長期的海拉細胞進行后續實驗。

1.3 實驗分組實驗設為四組，每組設置3 個復孔，分別為0、100、200、500 mL/L 復方苦參注射液組（濃度梯度設定根據預實驗結果）。將對數增殖期的海拉細胞接種于96 孔板中，置37 ℃培養箱中繼續培養，24 h 后棄去原培養基，其中0 mL/L 復方苦參注射液組加入含等體積的二甲基亞砜的培養基，其余各組分別加入含終濃度為100、200、500 mL/L復方苦參注射液的培養基。將各組海拉細胞置37 ℃培養箱中繼續培養48 h。

1.4 CCK-8法檢測各組海拉細胞干預48 h后，分別向每孔細胞中加入10 μL CCK-8 試劑，輕輕混勻，置37 ℃培養箱中繼續孵育4 h，用酶標儀檢測每孔細胞吸光度，波長為450 nm。實驗重復3 次，取均值，以測得的吸光度反映細胞增殖能力。

1.5 平板克隆形成實驗各組處于對數生長期的海拉細胞以200/皿接種于60 mm 的培養皿中，于37 ℃培養箱中培養14 d 左右，皿中出現肉眼可見的細胞克隆時終止培養，除去培養上清液，以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）浸洗2 次，用多聚甲醛（40 g/L）固定15 min，然后使用Giemsa 染色15 min，洗去染液，空氣中干燥，在倒置顯微鏡下觀察并計數≥50 個細胞克隆數，計算克隆形成率，克隆形成率=（克隆形成數/200）×100%。

圖1 流式細胞儀檢測不同濃度復方苦參注射液干預組宮頸癌海拉細胞凋亡情況

1.6 流式細胞術檢測細胞周期各組海拉細胞處理48 h后，收集并以0.25%的胰蛋白酶消化細胞，用PBS 洗滌細胞2次，離心去上清，調整細胞濃度為1×106個/毫升，向細胞中添加碘化丙啶（PI）染液，置冰上避光染色30 min，加入等體積的PBS，使用流式細胞儀檢測各組細胞周期比例。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡收集處理48 h 后各組海拉細胞，用不含乙二胺四乙酸的0.25%的胰蛋白酶消化細胞，用預冷的PBS洗滌細胞，離心棄上清，分別向各組細胞中添加結合緩沖液500 μL，制成1×106個/毫升的單細胞懸液，再依次加入膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和PI 各5 μL，避光反應15 min，1 h內上流式細胞儀檢測。

1.8 酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測不同濃度的復方苦參注射液干預海拉細胞48 h 后，收集細胞培養上清液，采用ELISA 檢測上清液中TGF-β1、TNF-α 和IL-4 含量。參照ELISA 說明書進行實驗操作，后續在酶標儀450 nm 波長處檢測，實驗重復3次，計算樣品中TGF-β1、TNF-α和IL-4含量。

1.9 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測海拉細胞經不同濃度的復方苦參注射液干預48 h 后，收集細胞，以Trizol 提取細胞中總RNA，使用逆轉錄試劑盒合成互補DNA（cDNA），調整cDNA 濃度，使用熒光定量PCR 檢測試劑盒進行擴增，反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環。反應結束后分析熔煉曲線，得出Ct 值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，采用2-ΔΔCt法計算各組海拉細胞中HLA-G mRNA 相對表達水平。HLA-G 引物：正向5’-GAGGAGACACGGAACACCAAG-3’；反向5’-GTCGCAGCCAATCATCCACT-3’。GAPDH引物：正 向5’-GTGAAGCAGGCGTCGGA-3’；反 向5’-AGCCCCAGCGTCAAAGG-3’。

1.10 蛋白質印跡法檢測不同濃度的復方苦參注射液干預海拉細胞48 h 后，分別收集各組細胞，添加細胞裂解液，冰上裂解30 min，離心提取細胞中總蛋白。采用BCA 法對蛋白定量后，蛋白樣品與加樣緩沖液按比例混合，加熱致蛋白變性，采用100 g/L的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后采用濕轉法將凝膠上的蛋白轉移至PVDF 膜上。在50 g/L 脫脂奶粉中封閉1 h，添加一抗（抗Bax 1∶500稀釋，抗Bcl-2 1∶500稀釋，抗cleaved-caspase-3 1∶800 稀釋，抗HLA-G 1∶500 稀釋），4 ℃過夜孵育。等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜15 min×3次，加入二抗1∶3 000 稀釋，室溫孵育1 h，TBST 洗膜15 min×3 次，化學發光，顯影，定影，以凝膠成像系統掃描拍照。以GAPDH 進行標定，采用Image J 軟件分析各蛋白條帶灰度值，計算各組細胞中目的蛋白表達水平。

1.11 統計學方法計量數據均以± s 表示，以軟件SPSS 21.0進行統計，采用單因素方差分析比較多組間差異，多組間的兩兩比較采用SNK-q 檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 復方苦參注射液對人宮頸癌海拉細胞增殖抑制的影響與0 mL/L 復方苦參注射液組比較，各復方苦參注射干預組細胞吸光度均降低（P＜0.05），克隆形成率明顯下降（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）。提示復方苦參注射可明顯抑制宮頸癌海拉細胞的增殖。見表1。

2.2 復方苦參注射液可阻滯海拉細胞周期進程與0 mL/L比，100、200、500 mL/L組G0/G1期細胞比例明顯升高，S 期細胞比例明顯降低（P＜0.05），G2/M 期細胞比例無變化（P＞0.05）。提示復方苦參注射液能夠阻滯宮頸癌海拉細胞周期進程。見表2。

2.3 復方苦參注射液可誘導海拉細胞凋亡0、100、200、500 mL/L 復方苦參注射液組細胞凋亡率分 別 為（6.02±0.35）% 、（14.38±1.06）% 、（20.62±1.57）%、（31.84±2.11）%（F=173.96，P＜0.001）；與0mL/L 比，100、200、500 mL/L 組細胞凋亡率升高（P＜0.05），且隨濃度的升高而升高（P＜0.05）。提示復方苦參注射液能夠呈濃度依賴性的誘導宮頸癌海拉細胞凋亡。見圖1。

表1 不同濃度復方苦參注射液干預組對人宮頸癌海拉細胞增殖的影響/± s

表1 不同濃度復方苦參注射液干預組對人宮頸癌海拉細胞增殖的影響/± s

注：①與0 mL/L 比，P＜0.05。②與100 mL/L 比，P＜0.05。③與200 mL/L比，P＜0.05。

組別0 mL/L 100 mL/L 200 mL/L 500 mL/L F值P值重復次數3 3 3 3吸光度2.43±0.11 1.97±0.08①1.41±0.08①②0.92±0.04①②③205.65＜0.001克隆形成率/%40.26±3.12 33.97±2.06①27.42±2.18①②19.84±2.03①②③40.44＜0.001

表2 不同濃度復方苦參注射液干預組對宮頸癌海拉細胞周期的影響/± s

表2 不同濃度復方苦參注射液干預組對宮頸癌海拉細胞周期的影響/± s

注：①與0 mL/L 比，P＜0.05。②與100 mL/L 比，P＜0.05。③與200 mL/L比，P＜0.05。

組別0 mL/L 100 mL/L 200 mL/L 500 mL/L F值P值重復次數3 3 3 3 G0/G1期69.02±2.06 75.98±2.13①80.24±2.07①②86.21±2.42①②③33.33＜0.001 S期23.86±1.17 19.33±1.02①13.49±0.88①②7.21±0.82①②③162.94＜0.001 G2/M期7.12±0.61 6.69±0.79 6.27±0.71 6.58±0.69 0.75 0.551

2.4 復方苦參注射液對海拉細胞中Bax、Bcl-2 和cleaved-caspase-3 蛋白表達的影響與0 mL/L 比，復方苦參注射液處理的海拉細胞中Bax 和cleavedcaspase-3 蛋白表達水平上調（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達水平下調（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）。表明復方苦參注射液可誘導Bax 蛋白表達，激活胱天蛋白酶（caspase）-3蛋白，抑制Bcl-2蛋白表達。見圖2，表3。

圖2 蛋白質印跡法檢測不同濃度復方苦參注射液干預組海拉細胞中Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-3蛋白水平

表3 不同濃度復方苦參注射液干預組海拉細胞中Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-3蛋白水平比較/± s

表3 不同濃度復方苦參注射液干預組海拉細胞中Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-3蛋白水平比較/± s

注：Bcl-2 為B 細胞淋巴瘤-2，Bax 為Bcl-2 相關X 蛋白，cleavedcaspase-3為活化胱天蛋白酶-3。①與0 mL/L 比，P＜0.05。②與100 mL/L 比，P＜0.05。③與200 mL/L比，P＜0.05。

組別0 mL/L 100 mL/L 200 mL/L 500 mL/L F值P值重復次數3333 Bcl-2 0.54±0.04 0.46±0.05①0.31±0.04①②0.17±0.02①②③58.60＜0.001 Bax 0.23±0.02 0.41±0.03①0.58±0.05①②0.82±0.07①②③87.58＜0.001 cleaved-caspase-3 0.12±0.02 0.44±0.05①0.79±0.08*&1.20±0.11①②③123.41＜0.001

2.5 復方苦參注射液對培養上清液中TGF-β1、TNF-α和IL-4含量的影響與0 mL/L 比，復方苦參注射液處理的海拉細胞上清液中TGF-β1 和IL-4 含量明顯降低（P＜0.05），TNF-α 含量明顯升高（P＜0.05）。提示復方苦參注射液可抑制細胞分泌TGFβ1和IL-4，促進TNF-α的分泌。見表4。

表4 不同濃度復方苦參注射液干預組海拉細胞培養上清液中TGF-β1、TNF-α和IL-4含量比較/± s

表4 不同濃度復方苦參注射液干預組海拉細胞培養上清液中TGF-β1、TNF-α和IL-4含量比較/± s

注：TGF-β1為轉化生長因子β1，TNF-α 為腫瘤壞死因子-α，IL-4為白細胞介素-4。①與0 mL/L 比，P＜0.05。②與100 mL/L 比，P＜0.05。③與200 mL/L比，P＜0.05。

組別0 mL/L 100 mL/L 200 mL/L 500 mL/L F值P值重復次數3333 TGF-β1/（μg/L）56.24±4.88 31.16±2.62①19.51±1.76①②6.62±0.46①②③157.37＜0.001 TNF-α/（ng/L）1.21±0.11 1.92±0.21①3.21±0.34①②4.26±0.40①②③66.45＜0.001 IL-4/（ng/L）3.53±0.36 2.82±0.25①1.89±0.28①②1.26±0.19①②③40.04＜0.001

2.6 復方苦參注射液對海拉細胞中HLA-G 基因表達的影響與0 mL/L 比，復方苦參注射液處理的海拉細胞中HLA-G mRNA 和蛋白表達降低（P＜0.05），且具有劑量依賴關系。說明復方苦參注射液能夠抑制海拉細胞中HLA-G基因的表達。見圖3，表5。

3 討論

圖3 蛋白質印跡法檢測不同濃度復方苦參注射液干預組海拉細胞中HLA-G蛋白水平

表5 不同濃度復方苦參注射液干預組海拉細胞中人白細胞抗原G（HLA-G）mRNA和蛋白表達水平比較/± s

表5 不同濃度復方苦參注射液干預組海拉細胞中人白細胞抗原G（HLA-G）mRNA和蛋白表達水平比較/± s

注：①與0 mL/L 比，P＜0.05。②與100 mL/L 比，P＜0.05。③與200 mL/L比，P＜0.05。

組別0 mL/L 100 mL/L 200 mL/L 500 mL/L F值P值重復次數3333 HLA-G mRNA 1.00±0.10 0.46±0.04①0.31±0.03①②0.20±0.02①②③503.30＜0.001 HLA-G蛋白0.23±0.02 0.17±0.02①0.11±0.01①②0.04±0.01①②③79.50＜0.001

復方苦參注射液具有多種抗癌活性成分，如苦參堿、脫氧苦參堿、氧化苦參堿及土茯苓等多種天然物質，具有抗癌、抗炎、清熱利濕等多種藥理學作用。近年來，復方苦參注射液誘導膀胱癌細胞、非小細胞肺癌細胞、肝癌等細胞凋亡的文獻較多［11-13］。因此，復方苦參注射液已成為抗腫瘤藥物的研究方向之一。本實驗證實，復方苦參注射液能夠抑制人宮頸癌海拉細胞的增殖，且呈劑量依賴性，阻滯細胞周期，誘導細胞凋亡。說明復方苦參注射液能夠抑制海拉細胞增殖，誘導細胞凋亡，具有較好的抗宮頸癌的作用。細胞凋亡蛋白caspase-3 激活形式為cleaved-caspase-3，激活后執行凋亡功能，誘導細胞發生凋亡［14］。Bax 屬于Bcl-2 基因家族中促凋亡基因，Bax 基因過表達能夠拮抗Bcl-2 的表達，導致細胞趨于死亡［15］。本實驗中復方苦參注射液干預的海拉細胞中caspase-3 激活增多，Bax 表達水平升高，Bcl-2 的表達水平下降，提示復方苦參注射液通過調控凋亡相關蛋白表達誘導海拉細胞發生凋亡。

多項研究證實，復方苦參注射液能夠調節免疫細胞的表達，增強機體免疫功能，改善腫瘤微環境，間接抑制腫瘤細胞增殖，殺傷腫瘤細胞［16-17］。復方苦參注射液能夠增強結腸癌、乳腺癌、宮頸癌等病人的免疫功能，延長病人生存時間［18-20］。報道指出，HLA-G 在腫瘤組織中呈高表達，且在相鄰的正常組織中很少發現，這表明HLA-G 與腫瘤生長和進展關系密切［21-22］。多項證據表明腫瘤細胞中HLA-G的上調參與癌癥免疫編輯的每個階段，包括清除、平衡和逃避［23-24］。數據顯示，HLA-G 在宮頸癌組織和細胞中呈高表達，發揮免疫耐受的作用［25］。本研究發現復方苦參注射液干預的宮頸癌海拉細胞中HLAG 表達水平下調，提示復方苦參注射液增強細胞免疫功能與抑制HLA-G基因的表達相關。

在腫瘤免疫中，復方苦參注射液可改善T 淋巴細胞亞群和自然殺傷細胞，在平衡Th1/Th2 細胞因子中發揮重要作用［26］。Th1 細胞主導機體免疫功能，TNF-α 主要由Th1 類細胞分泌，IL-4 主要由Th2類細胞分泌。有研究顯示，HLA-G 與TNF-α、IL-4和IL-10 共同參與先兆子癇中存在的Th1/Th2 細胞因子失衡與缺乏免疫調節特征相關，導致母親和胎兒之間的免疫耐受受損［27］。研究指出，阻斷HLA-G 導致結核性胸腔積液中T細胞分泌的γ干擾素和TNFα 含量增加［28］。本實驗檢測結果顯示，IL-4 含量明顯降低，TNF-α 含量明顯升高，提示淋巴細胞向Th1移動，說明復方苦參注射液通過抑制HLA-G 的表達逆轉Th1/Th2 失衡增強細胞免疫功能，與上述研究相符。TGF-β1 是一種由活化的T 淋巴細胞或B 淋巴細胞產生的細胞生長轉化調節因子，在腫瘤細胞中大量表達。目前報道顯示，復方苦參注射液通過抑制TGF-β1 的表達抑制腫瘤細胞的增殖［29］。本實驗中復方苦參注射液處理后，TGF-β1 含量降低，提示復方苦參注射液可能通過調控TGF-β1 的表達進而負調控HLA-G參與細胞免疫調節。

綜上，復方苦參注射液能夠有效誘導宮頸癌海拉細胞凋亡，其作用機制可能與抑制HLA-G 基因表達進而增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用有關。復方苦參注射液成分復雜，究竟何種成分發揮主導作用需進一步實驗進行論證，且目前只在單一細胞株中進行探究尚顯不足，后續實驗將在多個細胞株及動物模型中進一步驗證。

（本文圖1見插圖9-2）