響應面分析法優化刺梨果多糖的脫色工藝

李倩倩，李淑芳，陳貴元，2*

（1.大理大學基礎醫學院，云南 大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南 大理 671000）

刺梨中豐富的維生素C含量可促使機體干擾素的合成，當干擾素進入人體后，主要通過細胞表面的受體作用激發細胞產生抗病毒的蛋白，阻止病毒在人體細胞中粘附、聚集、定植和過度繁殖，從而達到抗病毒的目的[1-2]。根據《中國食品成分標準版》，新鮮成熟的刺梨中維生素C含量為2585.0mg/100g，是蘋果的861.67倍，檸檬的117.5倍，中華獼猴桃的41.69倍[3]。刺梨中富含多糖[4]、多酚[5]、黃酮[6]、超氧化物歧化酶[7]等重要的生化分子。至此，越來越多的相關產品并非簡單地將刺梨果原材料進行初步加工，而是趨向于以刺梨果水提物為原料進行深度加工[8]。眾所周知，采用水提醇沉法[9]浸提的刺梨多糖色澤呈黑褐色、渾濁、黏稠度增加，大量色素的存在會干擾后續的分離純化、質量分析、結構剖析以及生物活性的研發[10-11]。鑒于此，對刺梨果水提物進行脫色的研究勢在必行。

針對植物多糖的脫色方式有活性炭[12]、樹脂[13]、過氧化氫[14]、反膠束[15]等主要的脫色方式，其中活性炭[16]具有吸附強、過濾快、比表面積大、內部空隙發達、理化性質穩定、耐熱、耐酸、耐堿等天然優勢[17]。綜上所述，利用活性炭吸附法對刺梨果多糖進行脫色。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨果：購自貴州省遵義市產品。活性炭：上海琪特分析儀器有限公司。98%濃硫酸溶液、蒽酮、無水葡萄糖、葡萄糖：以上為分析純，均來自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TGL-16B高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；RE-3000型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器有限公司；UV-8000紫外可見光分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨果多糖的制備 挑選新鮮刺梨鮮果，50℃烘干粉碎后過80目篩，制得刺梨果粉末。稱取刺梨果粉末采用石油醚回流脫脂，過濾收集殘渣烘干備用。采取熱水浸提刺梨果多糖水溶液，收集提取液用離心機在4000r/min條件下離心15min，收集所有上清液，利用真空濃縮的方式減壓濃縮至適量體積，然后加入4倍體積的無水乙醇靜置過夜。之后使用丙酮洗脫殘留的有機小分子，保留沉淀，冷凍干燥制成刺梨粗多糖[18]。準確稱取適量刺梨粗多糖，配置成0.5mg/ml的刺梨果多糖水溶液，保存備用。

1.3.2 活性炭的預處理 將活性炭用去離子水洗滌多次，洗至中性，烘干后研磨成粉末型活性炭，保存備用[19]。

1.4 測定方法

1.4.1 葡萄糖標準曲線的繪制 現配置蒽酮-濃硫酸試劑。葡萄糖對照品溶液的配制：配制得1mg/ml的標準葡萄糖儲備液。精密吸取標準葡萄糖儲備液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml置于7個2.0ml容量瓶中，加水稀釋定容，振蕩搖勻。標準曲線繪制：準確吸取上述葡萄糖對照品溶液依次各2.0ml于錐形瓶中，然后緩慢依次加入蒽酮-濃硫酸試劑4ml，輕輕振蕩混勻，每支試管加完后同時置于沸水浴中加熱10min，取出后冷卻到室溫。以去離子水作參比，于波長620nm處檢測吸光度。以標準葡萄糖儲備液的質量濃度（mg/ml）為X軸；各樣品的吸光值（A620）為Y軸，繪制標準曲線。葡萄糖線性回歸方程：Y=1.6579X+0.0141（R2=0.9994），表明葡萄糖標準溶液質量濃度在0～0.6（mg/ml）范圍內與吸光度值呈現良好的線性關系[20]。

1.4.2 脫色率的測定與計算 如圖1所示，將刺梨果多糖在200～800nm波長范圍內進行雙束紫外可見光全波長掃描，故無法測定其吸收值。由于刺梨果多糖溶液脫色前后稀釋均為橙褐色或者橙黃色，依據互補色原理，刺梨果多糖溶液主要吸收藍色波段（446～464nm）可見光[21]。因此，選擇處于藍色波段中心的450nm波長作為檢測波長，進而測定其吸光度值（A450），其脫色率計算公式如下：

圖1 刺梨粗多糖的全波長掃描

式（1）中，A表示脫色率，%；A0代表刺梨果多糖溶液通過活性炭脫色前于450nm處的吸光度值；A1代表刺梨果多糖溶液通過活性炭脫色后于450nm處的吸光度值。

1.4.3 多糖保留率的測定及計算 本試驗采用蒽酮-濃硫酸法來測刺梨果多糖的含量，其多糖保留率計算公式如下：

式（2）中，C表示多糖保留率的綜合評分，分；C0代表刺梨果多糖溶液脫色前多糖色素質量濃度，mg/ml；C1代表刺梨果多糖溶液脫色后多糖色素質量濃度，mg/ml。

1.4.4 綜合評分 根據采用數據加權平均法，將刺梨果多糖的脫色率和多糖保留率兩者的權重值均設為50，總分計算為100分，其綜合評分計算公式如下[22]：

式（3）中，B表示脫色率的綜合評分，分；A表示脫色率，%；Amax表示脫色率的最大值，%；C表示多糖保留率，%；Cmax表示多糖保留率的最大值，%。

1.5 工藝優化

1.5.1 單因素試驗

1.5.1.1 在固定活性炭添加量1.5%、脫色溫度60℃的條件下，評價不同脫色時間（10min、20min、30min、40min、50min）對刺梨果多糖脫色率的影響。

1.5.1.2 在設定反應條件為活性炭添加量1.5%、脫色時間30min的情況下，分析不同脫色溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）對刺梨果多糖脫色率的影響。

1.5.1.3 在控制反應條件為脫色時間30min、脫色溫度60℃的情況下，比較不同活性炭添加量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）對刺梨果多糖脫色率的影響。

以上3組單因素試驗均進行3次重復試驗，以考察各種因素對刺梨果多糖脫色率和多糖保留率的影響。

1.5.2 Box-Behnken試驗設計 在上述3組單因素試驗基礎上，進一步研究脫色時間（A）、脫色溫度（B）和活性炭添加量（C）3個自變量之間的交互作用，以脫色率和多糖保留率組成的脫色效果綜合評分（Y）為指標，應用Box-Behnken試驗原理，采用3因素3水平響應面分析法進行試驗設計（共17組），響應面因素水平編碼如表1所示。

表1 響應面設計試驗因素與水平

1.6 數據統計與分析

采 用Design-Expert10.0、Excel、Origin9.0等分析軟件對數據進行統計分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 脫色時間對脫色工藝的影響 如圖2所示，隨著脫色時間的延長，脫色率大致呈直線上升趨勢，但是多糖保留率在20min時出現最高峰，之后呈逐步下降趨勢。這可能是由于活性炭脫色是一個動態的吸附與解吸過程，吸附平衡的時間剛好為40min左右，40min之后，脫色效果隨時間的增加只是略微增加，基本趨于飽和吸附狀態[23]。

圖2 脫色時間對刺梨果水提取物脫色率與多糖保留率的影響

如圖3所示，綜合考慮選取脫色時間20min、30min和40min作為響應面優化的3個水平。

圖3 脫色時間對刺梨果水提取物綜合評分的影響

2.1.2 脫色溫度對脫色工藝的影響 如圖4所示，當脫色溫度小于40℃時，脫色率曲線呈現直線上升趨勢。可能由于溫度增高則勢能提高，勢能轉變成動能，分子擴散速度加快，加強了色素顆粒與活性炭之間的互相碰撞機會，使脫色率不斷上升[24]。當脫色時間到達40℃時，活性炭對色素顆粒的吸附能力達到平衡；40℃之后，活性炭可以將已經吸附的組分脫附下來，簡稱為“升溫脫附[25]”，致使脫色率呈現緩慢下降趨勢。多糖保留率隨脫色溫度的升高呈下降的趨勢，可能是由于在較低溫度時多糖提取液黏度降低，有利于糖液中色素的擴散，活性炭吸附色素的同時也會對刺梨果多糖分子吸附，同時溫度的升高多糖提取液發生焦糖化，致使多糖保留率呈現下降趨勢[26]。

圖4 脫色溫度對刺梨果水提取物脫色率與多糖保留率的影響

如圖5所示，綜合考慮將脫色溫度20℃、30℃和40℃作為響應面優化的3個水平。

圖5 脫色溫度對刺梨果水提取物綜合評分的影響

2.1.3 活性炭添加量對脫色工藝的影響 如圖6所示，活性炭添加量在0.5%～1.5%范圍內，脫色率與活性炭添加量成正比，但是多糖保留率與活性炭添加量成反比。可能是由于活性炭添加量的增加會增大分子之間相互吸附的能力，即“凡德瓦引力[27]”，相應的吸附量也逐漸升高，致使溶液中的色素分子及多糖類物質越來越多地被吸附，從而出現脫色率不斷增加、多糖保留率持續降低的現象，但是當活性炭內孔徑被填滿時，則會出現脫色率下降的現象。

圖6 活性炭添加量對刺梨果水提取物脫色率與多糖保留率的影響

如圖7所示，綜合考慮選取活性炭添加量1%、1.5%和2%作為響應面優化的3個水平。

圖7 活性炭添加量對刺梨果水提取物綜合評分的影響

2.2 脫色工藝的響應面優化

2.2.1 響應面試驗的結果與方差分析 響應面試驗設計結果如表2所示，刺梨果多糖脫色率與多糖保留率構成的脫色效果綜合評分（Y）與各因素的二次方程模型：

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

由表3的回歸模型方差分析可知，回歸模型達到極顯著水平（p＜0.0001），表明該模型具有極顯著意義；失擬項不顯著（p＞0.05），則回歸模型與實際地試驗值無明顯差異。模型的一次項A、B、C，交互項AC以及二次項A2、B2、C2對脫色效果有極顯著的影響（p＜0.0001）。F值為方差檢驗，各因素對響應值影響強弱的順序：B＞A＞C，說明脫色溫度（B）對響應值的影響最顯著。模型的校正決定系數R2Adj=0.994 7，說明該擬合模型所解釋的因變量變化百分比為99.47%。模型的復相關系R2=0.9977，表明該模型擬合程度較高。

表3 Box-Behnken試驗方差分析

2.2.2 各因素對刺梨果多糖脫色素交互影響的等高線圖和響應面圖 等高線（圖8a、圖9a、圖10a）的形狀及疏密程度可以反映2因素交互效應的強弱大小，等高線呈橢圓形且曲線密集表示2因素之間相互作用顯著，若為圓形且曲線稀疏表示2因素對響應面的影響不顯著[28]。如圖9a所示，脫色時間和活性炭添加量的等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用顯著；圖8a的等高線呈圓形，說明脫色時間和脫色溫度2因素之間的交互作用不明顯，此結果與方差分析結果一致。

通過響應面（圖8b、圖9b、圖10b）可更直觀分析各因素對響應值的影響以及各因素間的交互效應。響應面的坡度反映各因素變化對響應值的影響，坡度相對較陡峭，則響應值對2因素的交互作用越敏感；坡度相對平緩，說明該因素對響應值的影響越小[29]。如圖9b所示，脫色時間和活性炭添加量2因素構成的響應面坡度較陡，表明脫色時間和活性炭添加量作用較為敏感。

圖8 脫色時間和脫色溫度對刺梨果多糖水溶液綜合評分的效果圖

圖9 脫色時間和活性炭用量對刺梨果多糖水溶液綜合評分的效果圖

2.2.3 最佳工藝參數的確定及驗證性試驗 根據二次多元回歸方程的擬合，得到最佳脫色工藝的預測值：脫色時間38.573min、脫色溫度32.092℃、活性炭添加量1.573%。此時最佳綜合評分為96.080分。

根據最佳工藝預測值將試驗條件調整為脫色時間40min、脫色溫度30℃、活性炭添加量1.5%對刺梨果多糖脫色率進行驗證性實驗，平行試驗3次，計算平均值，在此條件下脫色率為72.16%，多糖保留率為74.25%，綜合評分為95.49分，接近預測值（96.080分），證明該回歸模型提供參數的可靠性具有實際意義。

3 結論

本試驗首次采用響應面法優化刺梨果多糖提取液活性炭脫色工藝，利用多元二次方程擬合因素與響應值之間的函數關系得到活性炭脫色的最優工藝參數：脫色時間40min、脫色溫度30℃、活性炭添加量1.5%，在此條件下脫色率為72.16%，多糖保留率為74.25%，綜合評分為95.49分，接近預測值（96.080分），可見該模型能較好地預測活性炭對刺梨果多糖脫色的效應。本試驗運用響應面分析法求得的各參數組合范圍全面，工藝參數具有精確性和可靠性，可以避免資源在實踐生產過程中的過度浪費。

活性炭脫色因其成本較低，脫色效果較好，同時因活性炭脫色是物理吸附過程，不會破壞多糖結構，也不會引入新的雜質，適合工業化生產的需要，但是活性炭吸附屬于非選擇性、不定項的物理吸附，在吸附色素的同時會吸附多糖，造成多糖含量的損失，同時活性炭為黑色細微粉末狀，本身顏色為黑色，也會對脫色過程帶來一定的色值影響，如何去除活性炭本身的影響將成為下一個研究方向。