厚殼貽貝McCaspase 3-4基因的克隆及其在幼蟲變態(tài)中的作用

劉志顯 李嘉政 梁鄰利 馮丹丹 梁 簫 楊金龍 , 竹攸汀

(1. 上海海洋大學(xué)國家海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室, 廣州 511458)

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是個(gè)體細(xì)胞在基因嚴(yán)格控制下的程序性死亡方式(Programmed cell death,PCD), 在疾病發(fā)生、機(jī)體免疫、器官退化與生成及變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[1,2]。細(xì)胞的凋亡過程包括了一系列細(xì)胞形態(tài)的變化, 如細(xì)胞體積收縮、染色質(zhì)凝結(jié)和凋亡小體(Apoptosome)的出現(xiàn)等[3]。細(xì)胞凋亡主要通過內(nèi)源性途徑和外源性途徑兩種方式觸發(fā)。前者包括線粒體功能受損引起的線粒體膜通透化性變化, 從而導(dǎo)致其釋放不同的促凋亡蛋白, 促凋亡蛋白的釋放會進(jìn)一步引起細(xì)胞色素c(Cytc)釋放, Cytc與凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)結(jié)合后可以激活caspase-9, 進(jìn)而水解活化caspase-3并引起細(xì)胞凋亡[4]。外源性途徑則是由死亡受體Fas結(jié)合配體FasL后, 招募并結(jié)合接頭蛋白FADD形成死亡信號復(fù)合體, 該復(fù)合體可以招募活化caspase-8, 并進(jìn)一步激活caspase-3或誘發(fā)內(nèi)源性凋亡[4,5]。上述兩種誘發(fā)細(xì)胞凋亡的信號通路最終都通過活化不同的Caspase分子來完成。

半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族是細(xì)胞凋亡的核心分子。在哺乳動物中, caspase家族至少存在2類13個(gè)成員, 其中一類主要參與炎癥反應(yīng), 而另一類則參與細(xì)胞凋亡[6,7]。參與細(xì)胞凋亡的caspase可分為起始caspase (Initiator caspase)和效應(yīng)caspase (Effector caspase)。在哺乳動物中, 前者包括caspase-2、8、9和10, 它們的N端具有較長蛋白互作前結(jié)構(gòu)域(Prodomain), 其中通常包含死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域DED或caspase招募結(jié)構(gòu)域CARD, 具有被結(jié)合死亡信號復(fù)合體并激活下游效應(yīng)caspase的功能[3]。后者包括caspase-3、6和7, 僅有一個(gè)較短的前結(jié)構(gòu)域, 能被啟始caspase水解激活, 然后通過切割不同細(xì)胞底物的方式引發(fā)凋亡[3,8]。因此, 以caspase-3為代表的效應(yīng)caspase在凋亡過程中起到了最終執(zhí)行者的作用。

細(xì)胞凋亡最初源于對線蟲發(fā)育的研究[9], 后來陸續(xù)在兩棲動物、尾索動物和昆蟲的變態(tài)過程中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞凋亡[10—14]。作為生物體自主有序的細(xì)胞死亡方式, 細(xì)胞凋亡在機(jī)體發(fā)育、組織退化和形成過程中發(fā)揮了不可或缺的作用[15]。動物發(fā)育的一種普遍方式是產(chǎn)生過多的組織和細(xì)胞, 然后在發(fā)育后期通過細(xì)胞凋亡進(jìn)行剔除, 以實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)钠鞴俟δ躘9]。針對動物變態(tài)的研究顯示, caspase-3介導(dǎo)下的細(xì)胞凋亡是調(diào)控變態(tài)的關(guān)鍵因素。例如在非洲爪蟾(Xenopus laevis)[10,11]、家蠶(Bombyx mori)[12]、玻璃海鞘(Ciona intestinalis)[13,14]和黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)[16]中, 均發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞凋亡參與調(diào)控組織退化及器官形成的證據(jù)。上述在模式生物中的研究表明, 細(xì)胞凋亡可能是生物變態(tài)過程中自主清除多余組織或器官的重要方式。此外, 雖然目前已有部分證據(jù)顯示細(xì)胞凋亡及caspase基因可能參與福建牡蠣(Crassostrea angulata)[17]、太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)[18]和文蛤(Meretrix meretrix)[19]等海洋貝類的變態(tài)過程, 但關(guān)于凋亡及caspase基因與海洋貝類變態(tài)之間的關(guān)系仍然知之甚少。

厚殼貽貝(M. coruscus)分布于我國黃渤海和東南沿海等地, 由于具有營養(yǎng)豐富、肉味鮮美和生長快速等特點(diǎn), 逐漸成為我國海洋貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要物種, 產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景巨大[20,21]。厚殼貽貝的生活史包括營浮游生活的擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲、殼頂幼蟲和眼點(diǎn)幼蟲及營半附著底棲生活的稚體和成貝兩個(gè)階段。在眼點(diǎn)幼蟲時(shí), 厚殼貽貝會尋找適宜生存的場所進(jìn)行附著并變態(tài)發(fā)育成稚貝。因此, 眼點(diǎn)幼蟲的變態(tài)是厚殼貽貝生命過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié), 決定了其能否成功發(fā)育為稚貝。貽貝在變態(tài)過程中會發(fā)生一系列形態(tài)和生理上的變化, 如纖毛環(huán)退化、鰓和足形態(tài)的變化等[22], 而細(xì)胞凋亡是否參與上述組織的退化及新形態(tài)的塑造卻仍不十分明確,因此有必要通過更多研究來進(jìn)一步了解caspase-3及其介導(dǎo)下的細(xì)胞凋亡在貽貝變態(tài)過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

厚殼貽貝成貝采自浙江省嵊泗縣枸杞島附近海域, 當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后, 利用過濾的自然海水(1.2 μm孔徑乙酸纖維濾膜過濾)在10 L的聚碳酸酯水族箱中暫養(yǎng)1周, 養(yǎng)殖水溫為21℃, 鹽度為30‰, 期間每日投喂青島大扁藻(Platymonas helgolandica)和湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)。實(shí)驗(yàn)正式進(jìn)行前3天停止喂食。在暫養(yǎng)結(jié)束后, 解剖5只成貝取得外套膜、唇瓣、腸、鰓、性腺、消化腺、足、血細(xì)胞和閉殼肌等組織樣品, 用于分析不同組織的基因表達(dá)情況。

厚殼貽貝眼點(diǎn)幼蟲參考Yang等[23]的方法, 通過實(shí)驗(yàn)室人工授精的方式獲得。眼點(diǎn)幼蟲在黑暗環(huán)境下以5 個(gè)/mL的密度培養(yǎng), 水溫18℃, 培養(yǎng)期間按5×104cells/mL密度投喂湛江等鞭金藻, 幼蟲用于變態(tài)階段基因表達(dá)、變態(tài)誘導(dǎo)和RNA干擾實(shí)驗(yàn)。

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈合成

用RNAiso Plus試劑(TaKaRa, 日本), 參照說明書提取厚殼貽貝不同組織和幼蟲變態(tài)時(shí)期樣品的總RNA, 利用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific, 美國)對提取的RNA進(jìn)行濃度和質(zhì)量檢測, 通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測。用SMARTer? RACE 5′/3′ Kit試劑盒(Clontech,日本), 參照說明書合成一鏈cDNA用于后續(xù)cDNA全長克隆。用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa, 日本), 參照說明書反轉(zhuǎn)錄cDNA并用于后續(xù)基因表達(dá)分析。

1.3 Caspase-3基因cDNA全長克隆

基于本實(shí)驗(yàn)室厚殼貽貝轉(zhuǎn)錄組文庫中的caspase-3基因ETS片段設(shè)計(jì)3′ 和5′ RACE擴(kuò)增引物(表 1),用SMARTer? RACE 5′/3′ Kit試劑盒進(jìn)行RACE擴(kuò)增。擴(kuò)增的目的片段通過DNA回收試劑盒(生工,上海)回收后連接至pMD19-T載體(TaKaRa, 日本)并導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α(生工, 上海)中, 將經(jīng)陽性克隆篩選后的目的菌株送至上海生工測序并拼接, 經(jīng)BLAST比對分析后確定為Caspase-3基因。

表1 厚殼貽貝Caspase-3基因cDNA全長克隆和mRNA表達(dá)分析所用的引物序列Tab. 1 Primers sequences used for cDNA cloning and M.coruscus caspase-3 gene mRNA expression analysis

1.4 基因序列分析

利用BLAST對克隆獲得的caspase-3cDNA全長進(jìn)行同源性分析; 利用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析目的基因開放閱讀框(ORF)及編碼氨基酸序列; 利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測目的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì); 利用PROSITE (https://prosite.expasy.org/)預(yù)測目的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域; 通過Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)對目的蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行多重比對分析后, 利用DNAman對多重比對結(jié)果進(jìn)行彩色標(biāo)記, 利用PhyML(http://www.atgc-montpellier.fr/phyml/)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(最大似然法, bootstrap重復(fù)計(jì)算100次)[24]。

1.5 qRT-PCR分析

將厚殼貽貝EF-1α作為內(nèi)參基因, 分別設(shè)計(jì)EF-1α及克隆獲得的caspase-3基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)引物(表 1)。利用FastStart Essential DNA Green Master試劑盒(Roche, 瑞士), 按照說明書進(jìn)行操作, 對厚殼貽貝不同組織和眼點(diǎn)幼蟲不同變態(tài)時(shí)間的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行分析。進(jìn)行組織表達(dá)分析的樣品分別取自獨(dú)立的5個(gè)成貝(n=5),進(jìn)行變態(tài)過程基因表達(dá)分析的為4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)組,每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)組包含200只眼點(diǎn)幼蟲(n=800), 上述每個(gè)樣品均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。將caspase-3基因在不同樣品中的相對豐度輸入JMP 10.0軟件, 通過單因素方差分析判斷其差異性,P<0.05表示顯著性差異。

1.6 RNA干擾實(shí)驗(yàn)

RNA干擾使用的siRNA(Short interfering RNA)序列由吉瑪公司(GenePharma, 上海)按照獲得的Caspase-3基因cDNA全長設(shè)計(jì)并合成(Caspase 3-4siRNA序列: 5′-GGCAGAACGUAACACAAAUTT-3′)。參考本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的方法[22,25],通過電穿孔方式對厚殼貽貝眼點(diǎn)幼蟲進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染: 眼點(diǎn)幼蟲首先在高壓滅菌過濾海水(AFSW)中進(jìn)行漂洗,然后將200只幼蟲分別轉(zhuǎn)移到只含有1 mL AFSW(空白對照組)、含有1 mL AFSW以及非目的基因siRNA(NC siRNA: 5′-UUCUCCGAACGUGUCAC GUTT-3′, 陰性對照組)以及含有1 mL AFSW和1.2 μgCaspase 3-4siRNA(實(shí)驗(yàn)組)的1.5 mL除酶Tube管中孵育5min后, 吸取幼蟲及siRNA混合物至直徑0.4 cm的電穿孔儀配套電極杯(Bio-Rad, 美國)中, 利用GenePulser Xcell(Bio-Rad)電穿孔儀進(jìn)行電擊。將電穿孔后的幼蟲樣品在室溫下保持10min, 然后轉(zhuǎn)移至AFSW中48h后收集幼蟲, 提取總RNA, 通過qRT-PCR檢測目的基因(caspase-3)的敲降情況, 所有RNA干擾實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)進(jìn)行4次(n=800)。

1.7 幼蟲變態(tài)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

參考Liang等[25], 利用腎上腺素(Epinephrine,EPI)誘導(dǎo)幼蟲進(jìn)行變態(tài)。在玻璃培養(yǎng)皿中加入20 mL含有EPI(10–4mol/L)的AFSW, 然后將20只眼點(diǎn)幼蟲置于其中連續(xù)暴露96h, 分別記錄暴露0、6h、12h、24h、48h、72h和96h后幼蟲的變態(tài)情況, 未加入EPI進(jìn)行變態(tài)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組作為空白對照, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置獨(dú)立的9個(gè)培養(yǎng)皿作為平行實(shí)驗(yàn)(n=180)。RNA干擾后檢測幼蟲變態(tài)率的實(shí)驗(yàn)中,分別設(shè)置無EPI誘導(dǎo)作為空白對照組(僅為AFSW加幼蟲, 包含電擊和非電擊), 加入EPI進(jìn)行變態(tài)誘導(dǎo)的作為陽性對照組(包括電擊和非電擊), 非目的基因RNA干擾后通過EPI誘導(dǎo)變態(tài)的作為陰性對照組, caspase-3 RNA干擾后EPI誘導(dǎo)變態(tài)的作為實(shí)驗(yàn)組。RNA干擾方法同上, 干擾完成后, 從不同實(shí)驗(yàn)組中各吸取20只幼蟲分別放置于9個(gè)獨(dú)立的培養(yǎng)皿中(含20 mL AFSW)培養(yǎng)24h后(n=180), 利用EPI進(jìn)行變態(tài)誘導(dǎo), 48h后統(tǒng)計(jì)幼蟲變態(tài)率, 同時(shí)統(tǒng)計(jì)幼蟲14d內(nèi)的存活率。

2 結(jié)果

2.1 厚殼貽貝caspase-3 cDNA全長的克隆及序列分析

通過RACE克隆技術(shù)獲得了一個(gè)厚殼貽貝caspase-3基因的cDNA全長, 序列提交于GenBank (登錄號: MZ400485)。根據(jù)已完成測序的全基因組數(shù)據(jù), 厚殼貽貝中共有3個(gè)caspase-3-like基因[26]。Blast比較結(jié)果顯示, 3個(gè)基因分別與地中海貽貝(Mytilus galloprovincialis)的Caspase 3/7-2、Caspase 3/7-3和Caspase 3/7-4高度相似, 其中, 本研究所克隆的基因與地中海貽貝Caspase 3/7-4相似率達(dá)到83.99%(Query Cover: 98%, Per Ident: 83.99%), 因此將其命名為McCaspase 3-4。McCaspase 3-4基因的cDNA全長為1269 bp, 含一個(gè)長度為855 bp的開放閱讀框(ORF), 編碼284個(gè)氨基酸, 另包含86 bp的5′端非編碼區(qū)(UTR)和328 bp的3′端非編碼區(qū)。根據(jù)氨基酸序列預(yù)測其蛋白分子量為32.599 kD, 等電點(diǎn)為5.11。

2.2 不同物種caspase-3蛋白的進(jìn)化分析

將厚殼貽貝McCaspase 3-4蛋白序列與智人(Homo sapiens)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、葉吻銀鮫(Callorhinchus milii)、玻璃海鞘(Ciona intestinalis)和地中海貽貝(M. galloprovincialis)caspase-3 的蛋白序列進(jìn)行比較, 結(jié)果顯示McCaspase 3-4與其他物種caspase-3一樣缺乏長的前結(jié)構(gòu)域(Prodomain), 但具有P20和P10這兩個(gè)典型caspase蛋白結(jié)構(gòu)域, 具有典型的caspase-3蛋白序列特征。McCaspase 3-4在P20結(jié)構(gòu)域末端具有識別并降解底物的半胱氨酸活性位點(diǎn)(KPKIFIFQCSRR), 但是其后半部分的核心五肽活性位點(diǎn)QACXG(X為R、Q或D)突變?yōu)镼CSRR。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示, McCaspase 3-4首先與無脊椎動物caspase-3和地中海貽貝(M. galloprovincialis)的caspase 3/7蛋白聚在一起, 然后再與caspase 3/7-4聚為一枝, 表明其在進(jìn)化上更接近c(diǎn)aspase 3/7-4(圖 1)。

圖1 不同物種Caspase-3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of caspase-3 protein from different species

2.3 McCaspase3-4基因在厚殼貽貝不同組織中的表達(dá)譜分析

利用qRT-PCR技術(shù)分析了McCaspase 3-4基因在厚殼貽貝成貝不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示, 該基因在不同組織中均有表達(dá), 但表達(dá)水平存在差異。其中, 在外套膜和唇瓣中的表達(dá)水平顯著高于其他組織(P<0.05), 在外套膜中表達(dá)量最高, 唇瓣中次之, 兩者之間無顯著差異(P<0.05)。腸、鰓、性腺、消化腺、足、血細(xì)胞和閉殼肌中Mc-Caspase 3-4基因的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異(P<0.05)。表達(dá)量較高的外套膜和唇瓣中該基因的表達(dá)水平分別為表達(dá)量最低的閉殼肌中的9.34和7.37倍(圖 2)。

圖2 厚殼貽貝成貝不同組織中McCaspase 3-4基因的表達(dá)水平分析Fig. 2 Relative expression of McCaspase 3-4 mRNA in different tissues of adult M. coruscus

2.4 McCaspase 3-4基因在幼蟲變態(tài)過程中的mRNA表達(dá)情況

EPI誘導(dǎo)眼點(diǎn)幼蟲變態(tài)后, 幼蟲在誘導(dǎo)早期(0—12h)未出現(xiàn)變態(tài)。在誘導(dǎo)24—48h后, 幼蟲變態(tài)率顯著增加, 并在72—96h后趨于平緩(圖 3A)。在此情況下,McCaspase3-4基因在EPI誘導(dǎo)6h后表達(dá)量開始出現(xiàn)顯著上升(P<0.05), 在誘導(dǎo)12—24h后出現(xiàn)較大幅度的上升, 并在24h時(shí)達(dá)到峰值, 此時(shí)表達(dá)量為初始表達(dá)量的3.0倍。在EPI誘導(dǎo)48h后,Mc-Caspase3-4的表達(dá)量開始出現(xiàn)顯著下降(P<0.05),并在誘導(dǎo)96h后降至最低。下降過程中, EPI誘導(dǎo)48h和72h后的McCaspase3-4表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05; 圖 3B)。

圖3 腎上腺素誘導(dǎo)厚殼貽貝眼點(diǎn)幼蟲不同時(shí)間后的變態(tài)率及McCaspase 3-4 mRNA表達(dá)情況分析Fig. 3 The metamorphosis rate and McCaspase 3-4 mRNA expression of pediveliger after epinephrine inducing

2.5 McCaspase 3-4基因RNA干擾效果驗(yàn)證

由于厚殼貽貝中除了McCaspase 3-4外還存在兩個(gè)capase-3基因(與地中海貽貝Caspase 3/7-2、Caspase 3/7-3近似, 暫時(shí)將其命名為caspase 3-2-like和caspase 3-3-like), 為明確RNA干擾結(jié)果僅特異性地對McCaspase 3-4有效, 因此通過qRT-PCR技術(shù)分別對轉(zhuǎn)染McCaspase 3-4siRNA后眼點(diǎn)幼蟲中caspase 3-2-like、caspase 3-3-like和McCaspase 3-4的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示, 成功轉(zhuǎn)染McCaspase 3-4siRNA后, 眼點(diǎn)幼蟲中的caspase 3-2-like和caspase 3-3-like的mRNA表達(dá)水平相比對照組未出現(xiàn)顯著下降, 而McCaspase 3-4的mRNA表達(dá)水平相較未轉(zhuǎn)染siRNA的空白對照組下降了約87%, 相比空白對照組和轉(zhuǎn)染非目的基因siRNA的陰性對照組(NC siRNA轉(zhuǎn)染)均呈現(xiàn)顯著下降(P<0.05; 圖 4A—C)。與此同時(shí), siRNA轉(zhuǎn)染14d后幼蟲的存活率與空白對照組相比無顯著差異(P<0.05; 圖 4D)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 通過電穿孔法轉(zhuǎn)染McCaspase 3-4siRNA可以特異性地敲降McCaspase 3-4基因的表達(dá), 對其他兩個(gè)caspase-3基因的表達(dá)未產(chǎn)生影響, 且對幼蟲生存狀況無影響,因此可用于后續(xù)進(jìn)行的基因功能研究。

圖4 RNA干擾McCaspase 3-4后眼點(diǎn)幼蟲中的不同caspase-3基因的表達(dá)情況和存活率分析Fig. 4 mRNA expression of different caspase-3 genes in the pediveliger and the larval survival rates after McCaspase 3-4 RNAi

2.6 McCaspase 3-4基因干擾后對幼蟲變態(tài)率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 對照組中, EPI誘導(dǎo)48h后, 眼點(diǎn)幼蟲的變態(tài)率為42.2%(腎上腺素誘導(dǎo), 圖 5)。未添加siRNA的電穿孔后再加EPI(空白組電擊+腎上腺素誘導(dǎo))及轉(zhuǎn)染非目的基因siRNA后再加EPI (NC siRNA轉(zhuǎn)染+腎上腺素誘導(dǎo))進(jìn)行變態(tài)誘導(dǎo)48h后, 眼點(diǎn)幼蟲的變態(tài)率分別為 29.8%和 25.7%, 與僅有EPI誘導(dǎo)的結(jié)果相比小幅度下降(圖 5)。轉(zhuǎn)染Mc-Caspase 3-4siRNA再利用EPI進(jìn)行變態(tài)誘導(dǎo)(Caspase 3-4siRNA轉(zhuǎn)染+腎上腺素誘導(dǎo)), 誘導(dǎo)48h后眼點(diǎn)幼蟲的變態(tài)率則為5.0%, 相比未加siRNA電穿孔再加EPI和NC siRNA轉(zhuǎn)染后加EPI的對照組相比存在較大幅度的顯著下降(P<0.05; 圖 5)。上述結(jié)果表明, 敲降McCaspase 3-4基因的表達(dá)會顯著降低眼點(diǎn)幼蟲的變態(tài)率。

圖5 RNA干擾McCaspase 3-4 48h后不同時(shí)間眼點(diǎn)幼蟲的變態(tài)率Fig. 5 Larval metamorphosis at 48h after McCaspase 3-4 RNAi

3 討論

3.1 McCaspase 3-4基因的鑒定及命名

Caspase-3是執(zhí)行細(xì)胞凋亡功能的核心分子之一[5], 其結(jié)構(gòu)包括較短的N-端前結(jié)構(gòu)域(Prodomain)、大亞基P20 (分子量大小約17—20 kD)和小亞基P10(分子量大小約10—12 kD)結(jié)構(gòu)域[19]。在P20上含有蛋白活性位點(diǎn)QACXG五肽保守序列(X為R、Q或D)[6]。本研究通過基因克隆得到了一個(gè)厚殼貽貝caspase基因的cDNA全長序列, 通過氨基酸序列對比, 發(fā)現(xiàn)其缺乏長的前結(jié)構(gòu)域, 具有的P20和P10結(jié)構(gòu)域, 因此是一個(gè)典型的caspase-3分子。

根據(jù)已有報(bào)道, 地中海貽貝(M. galloprovincialis)中存在Caspase-3/7-1、Caspase-3/7-2、Caspase-3/7-3和Caspase-3/7-4四個(gè)caspase-3基因, 厚殼貽貝中的3個(gè)caspase-3基因分別與Caspase 3/7-2、Caspase 3/7-3和Caspase 3/7-4高度相似[26,27]。本研究克隆的caspase-3基因所編碼的氨基酸序列與地中海貽貝caspase 3/7-4分子相似度最高, 結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹中本基因與地中海貽貝caspase 3/7-4最終聚為一枝的結(jié)果, 表明本基因可能是地中海貽貝caspase 3/7-4的直系同源基因(Orthologous gene)。為保持不同caspase-3基因在不同貽貝物種中命名的統(tǒng)一性, 因此將本基因命名為McCaspase 3-4。

3.2 水解功能核心五肽位點(diǎn)突變不影響McCaspase 3-4的變態(tài)調(diào)控功能

與很多蛋白類似, 日常狀態(tài)下的caspase以無活性的酶原形式貯存于細(xì)胞內(nèi), 當(dāng)接收到死亡信號時(shí),啟始caspase酶原通過自發(fā)的催化水解作用激活自己, 并進(jìn)一步激活位于其下游的效應(yīng)caspase[5]。Caspase的水解激活需要經(jīng)過兩次裂解, 首先是分離P20大亞基和P10小亞基, 然后是去除N端前結(jié)構(gòu)域(Prodomain)[28]。水解激活后的效應(yīng)caspase會通過P20亞基末端以半胱氨酸(Cysteine)為核心的五肽活性位點(diǎn)QACXG識別細(xì)胞底物中的天冬氨酸并降解底物, 從而實(shí)現(xiàn)凋亡。本研究通過對比不同物種caspase-3的蛋白序列, 發(fā)現(xiàn)McCaspase 3-4蛋白的P20功能域后端雖然具有半胱氨酸活性位點(diǎn)KPKIFIFQCSRR, 但該位點(diǎn)后部核心五肽位點(diǎn)QACXG中的3個(gè)氨基酸卻出現(xiàn)了突變, 突變?yōu)镼CSRR。在地中海貽貝的4個(gè)Caspase-3/7中, Caspase-3/7-1和2具有完整的QACXG五肽位點(diǎn), Caspase-3/7-3的五肽位點(diǎn)為QACRT, 僅最后一個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了突變, 而Caspase-3/7-4的五肽位點(diǎn)為QCSRK, 與本研究中McCaspase 3-4的QCSRR類似, 均為第二、三和五號位氨基酸發(fā)生突變[27]。利用紫外線(UV)和LPS、CPGs、LTA、Poly I:C等病原相關(guān)模式分子對地中海貽貝血細(xì)胞進(jìn)行刺激后的結(jié)果顯示,Caspase-3/7-3和Caspase-3/7-4在紫外線刺激后的較短時(shí)間內(nèi)基因表達(dá)達(dá)到峰值, 顯著高于Caspase-3/7-1和Caspase-3/7-2, 表明這兩個(gè)基因在紫外線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中可能具有較為重要的作用[27]。而在不同細(xì)菌病原相關(guān)模式分子刺激后,Caspase-3/7-3和Caspase-3/7-4的表達(dá)量卻沒有如Caspase-3/7-1和Caspase-3/7-2一般出現(xiàn)顯著上調(diào), 提示僅Caspase-3/7-1和Caspase-3/7-2在免疫應(yīng)答引發(fā)的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了主要作用[27]。上述結(jié)論表明, 雖然Caspase-3/7-3和Caspase-3/7-4的五肽核心活性位點(diǎn)發(fā)生了突變, 但其仍然具有凋亡活性, 不同caspase 3可能在不同條件引發(fā)的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用。因此, 這可能也是McCaspase 3-4的五肽位點(diǎn)出現(xiàn)突變后仍然具有幼蟲變態(tài)調(diào)控功能的原因。然而, 是什么原因?qū)е略撐稽c(diǎn)發(fā)生突變, 為什么突變后仍可以執(zhí)行細(xì)胞凋亡和變態(tài)調(diào)控的功能, 以及發(fā)生突變裂解底物是否發(fā)生了變化, 仍值得進(jìn)一步深入探討。

3.3 caspase-3在貝類免疫及纖毛更替過程中具有潛在功能

基于不同物種中的研究顯示,caspases基因在動物的不同組織中均有表達(dá)[18,27,29,30]。在本研究中,McCaspase 3-4在厚殼貽貝的各個(gè)組織器官中均有表達(dá), 表明該基因在厚殼貽貝體內(nèi)同樣有廣泛分布。海洋貝類中的研究顯示, 在福建牡蠣(C. angulata)和太平洋牡蠣(C. gigas)成貝中,caspase-3基因在鰓和唇瓣上的表達(dá)量最高, 外套膜次之[17,18]。由于鰓和唇瓣都是貝類在生存過程中直接接觸外界環(huán)境的組織器官, 更容易受到病原體的侵入和損傷,表明caspase-3在貝類中可能同樣參與免疫反應(yīng)[18]。此外, 地中海貽貝(M. galloprovincialis)和雜色鮑(Haliotis diversicolor)中的研究表明, caspase參與宿主的免疫防御[27,31]。本研究中,McCaspase 3-4在外套膜和唇瓣中的表達(dá)較高, 且顯著高于閉殼肌、腸和消化腺等其他組織器官。外套膜和唇瓣是厚殼貽貝直接接觸外界環(huán)境的組織,McCaspase 3-4在這兩種組織中的高表達(dá), 提示該基因可能在機(jī)體免疫過程中發(fā)揮作用, 但是由于唇瓣作為貝類輔助攝食器官, 其上面的纖毛需要不斷更新, 在此過程中可能也需要caspase參與, 因此McCaspase 3-4是否真正參與機(jī)體免疫過程, 仍需更多深入研究。

3.4 caspase-3介導(dǎo)下的細(xì)胞凋亡在貝類變態(tài)過程中的作用

附著變態(tài)是雙殼貝類幼蟲發(fā)育中的重要階段,腎上腺素(EPI)是能夠誘導(dǎo)厚殼貽貝眼點(diǎn)幼蟲變態(tài)的神經(jīng)遞質(zhì)之一[32]。本研究通過EPI誘導(dǎo)了厚殼貽貝眼點(diǎn)幼蟲變態(tài), 結(jié)果表明, 誘導(dǎo)24h后眼點(diǎn)幼蟲開始出現(xiàn)變態(tài), 誘導(dǎo)48h后變態(tài)進(jìn)入高峰期。與幼蟲變態(tài)時(shí)間相比,McCaspase 3-4在EPI誘導(dǎo)12h后開始出現(xiàn)顯著高表達(dá), 在誘導(dǎo)24h后表達(dá)量達(dá)到最高。該結(jié)果與caspase-3基因在福建牡蠣(C. angulata)和太平洋牡蠣(C. gigas)幼蟲變態(tài)過程中的表達(dá)情況類似[17,18]。在福建牡蠣中,caspase-3基因在附著開始后6h達(dá)到顯著高表達(dá), 而在太平洋牡蠣中,caspase-3基因CgCASP-3同樣在幼蟲附著后6h開始顯著高表達(dá), 并在附著12—24h后表達(dá)量達(dá)到最高[17,18]。將該結(jié)果與EPI誘導(dǎo)后幼蟲的變態(tài)時(shí)間相比, 一方面表明McCaspase 3-4可能參與了眼點(diǎn)幼蟲的變態(tài),另一方面也表明在幼蟲變態(tài)過程中, 細(xì)胞凋亡的發(fā)生應(yīng)該早于變態(tài)表型的出現(xiàn)。

迄今為止, 已有證據(jù)表明caspase-3及其介導(dǎo)下的細(xì)胞凋亡參與調(diào)控動物的變態(tài)發(fā)育。例如, 細(xì)胞凋亡在非洲爪蟾(X. laevis)的尾部退化、腸道和皮膚重塑等變態(tài)過程中均起到重要作用[10,11]; 細(xì)胞凋亡參與調(diào)控玻璃海鞘(C. intestinalis)幼蟲變態(tài)過程中的尾部退化[13,14]; 細(xì)胞凋亡在昆蟲幼蟲變態(tài)時(shí)唾液腺、絲腺、中腸和脂肪體的退化, 以及觸角側(cè)枝的形成中起關(guān)鍵作用[12,28]。然而, 針對細(xì)胞凋亡參與海洋貝類變態(tài)過程的研究卻仍然較為薄弱, 在福建牡蠣(C. angulata)、太平洋牡蠣(C. gigas)和文蛤(M. meretrix)中的研究結(jié)果顯示,caspase-3基因在眼點(diǎn)幼蟲變態(tài)時(shí)的表達(dá)量顯著高于其他幼蟲期, 原位雜交結(jié)果顯示變態(tài)時(shí)caspase-3主要分布于足和面盤上, 暗示caspase-3參與變態(tài)時(shí)足和面盤的變化[17—19]。本研究通過siRNA轉(zhuǎn)染成功敲降了McCaspase 3-4基因的表達(dá), 結(jié)果顯示, 干擾McCaspase 3-4后的眼點(diǎn)幼蟲變態(tài)率顯著減少, 較為充分地證明了McCaspase 3-4參與調(diào)控眼點(diǎn)幼蟲的變態(tài)。

本研究獲取了厚殼貽貝McCaspase3-4基因的cDNA全長, 通過分析各組織和眼點(diǎn)幼蟲變態(tài)過程中caspase-3的基因表達(dá)情況, 推測該基因可能參與厚殼貽貝眼點(diǎn)幼蟲的變態(tài)。siRNA轉(zhuǎn)染干擾McCaspase 3-4基因表達(dá)的結(jié)果進(jìn)一步表明,McCaspase 3-4基因在幼蟲變態(tài)發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。