桂附地黃丸（濃縮丸）中熟地黃的薄層色譜鑒別方法的建立

魏艷蕓,王月玲，王 蕙

（蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，甘肅 蘭州 730050）

桂附地黃丸（濃縮丸）由熟地黃、附子、肉桂、澤瀉、山藥、山茱萸、茯苓及牡丹皮等八味藥組成，該處方是由漢代張仲景《金匱要略》加減而來，具有溫補腎陽之功效，全方溫而不燥，補而不膩，故得到極為廣泛的應用。現代醫學研究表明，桂附地黃丸具有改善腎功能、增強免疫力、預防腫瘤、抗突變、延緩衰老及對抗活性自由基的作用，還有降血糖及改善胰島素耐受性、改善高脂血癥，升高高密度脂蛋白、促進造血功能恢復、改善微循環、降血壓、促進性激素分泌，預防電離輻射損傷等作用[1-6]。其中，該方以熟地黃滋陰補血，填精補髓為主藥。熟地黃是玄參科植物地黃（Rehmannia Glutinosa Libosch）新鮮或者干燥塊根經過蒸制或者酒燉而來，味屬甘，性微溫；歸肝；滋陰補血,益精填髓，用于貧血，月經不調,崩漏下血，肝腎陰虛，腰膝酸軟，盜汗遺精，暈厥，耳鳴，須發早白之效，熟地黃被冠為“壯水之主，補血之君”“補精之王”等稱號[7-10]。

目前，國內有關桂附地黃其他劑型的制劑的質量標準研究均已比較完善[11-12]，而桂附地黃丸（濃縮丸）的質量標準相對滯后，其現行標準自1993年收入衛生部藥品標準中藥成方制劑第八冊以來，再未進行過任何修訂，標準正文項下考察了性狀、鑒別和含量測定3個項目，鑒別項下僅對粉末入藥的牡丹皮、附子（制）、肉桂、山藥進行了顯微鑒別，對浸膏入藥的主藥熟地黃無任何鑒別方法。

為保證藥品質量，患者安全用藥，確保藥物療效，本研究以熟地黃對照藥材為參照標準，通過考察各薄層色譜影響條件，旨在建立一種熟地黃的薄層色譜鑒別方法，為桂附地黃丸（濃縮丸）的質量評價提供參考。

1 材料

1.1 試劑與儀器

硅膠G板（青島海洋化工廠）規格：10 cm×10 cm，厚度0.2～0.25 mm；10 cm×20 cm，厚度0.2～0.25 mm；硅膠GF254板（青島海洋化工廠）規格：10 cm×10 cm，厚度0.2～0.25 mm；層析缸（上海信誼儀器廠）；數顯干燥箱（DHG-90708）；薄層半自動（點樣）成像系統（Visualizer/linomat5）；超聲波清洗機（SB25-12DT）；數控恒溫水浴鍋（SCG-2）；試劑均為分析純。

1.2 對照藥材

熟地黃對照藥材，中國食品藥品檢定研究院，批號：121196-202007，規格1 g。

1.3 供試品

桂附地黃丸（濃縮丸），各批次樣品信息見表1。

表1 桂附地黃丸（濃縮丸）各批次樣品信息

續表1

2 方法與結果

2.1 薄層色譜條件優化

2.1.1 供試品溶液制備方法考察

用以下3種方法制備供試品溶液，在不同色譜條件下進行展開。

方法（1）：稱取本品2.5 g，研細，加100 mL水，溫熱使之充分溶散，再加熱至沸騰，冷卻，用脫脂棉進行濾過，取濾液，濾液用乙酸乙酯提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL使之充分溶解，即得。

方法（2）：稱取本品2.5 g，研細，加20 mL乙醇，冷浸24 h，濾紙濾過，濾液水浴濃縮至1 mL，即得。

方法（3）：稱取本品2.5 g，研細，加80%甲醇溶液50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣中加入5 mL水使之溶解，再用水飽和正丁醇溶液振蕩提取4次，每次10 mL，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL使之充分溶解，即得。

通過不同展開劑展開，不同條件顯色比較，結果顯示，以方法（1）制備的供試品溶液，在薄層色譜圖中主成分斑點清晰，與對照藥材溶液顯現的斑點較為一致，且分離效果好；以方法（2）、（3）制備的供試品溶液顯現斑點較少。故選擇方法（1）進行供試品溶液制備，見圖1。

2.1.2 對照藥材溶液制備

稱取熟地黃對照藥材2 g，加乙醇20 mL，冷浸24 h，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶液使之溶解，作為對照藥材溶液。

2.1.3 陰性對照溶液制備

按照桂附地黃丸（濃縮丸）的處方比例，稱取缺熟地黃的各味藥材，模擬處方制得缺少熟地黃的陰性對照樣品（稱取澤瀉、茯苓各2.22 g研碎成粗粉，過2號篩，加水20 mL煎煮兩次，每次煎煮時間2 h，合并煎液，過濾，濾液合并，濃縮；稱取山茱萸2.96 g、牡丹皮2.22 g，用70%乙醇為溶劑浸漬24 h，回收乙醇，再濃縮，稱取剩余藥物肉桂0.74 g、附子0.74 g、山藥2.96 g粉碎成細粉，與上述各濃縮液混合均勻，即得）。然后再按照供試品溶液制備方法（1）制成陰性對照溶液。

2.1.4 展開系統考察

選擇4種展開系統，分別點樣，進行薄層色譜條件考察：①硅膠G板，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑；②硅膠G板，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑；③硅膠G板，以三氯甲烷-甲醇（12∶1）為展開劑；④硅膠GF254板，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑。

通過在不同條件下顯色，結果顯示，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1）或三氯甲烷-甲醇（12∶1）為展開劑時，各主斑點比移值較小，不能做到斑點有效分離；以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，在硅膠G板或硅膠GF254板上展開時，各主斑點顯色清晰，展開距離適中，分離效果好。故選擇以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，見圖1。

2.1.5 顯色方法及檢視條件考察

選擇三種顯色方法，對不同展開條件的薄層板顯色觀察：①晾干，噴以2,4-二硝基苯肼乙醇試液，日光下檢視；②晾干，噴以二硝基苯肼試液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視；③晾干，噴以2%硫酸香草醛，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，日光燈下檢視；④在紫外光（254 nm）下檢視。

結果顯示，以二硝基苯肼試液為顯色劑，各主斑點顯色良好，而在105 ℃加熱后，各斑點顯色更為清晰；以2%硫酸香草醛為顯色劑時，對照主斑點不能良好顯色；在254 nm紫外燈下檢視時，對照主斑點亦顯色不清晰。故選擇噴以二硝基苯肼試液為顯色劑，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視，見圖1。

圖1 桂附地黃丸（濃縮丸）中熟地黃薄層鑒別色譜條件優化圖譜

利用不同展開系統及不同顯色方法，對各供試品溶液照薄層色譜法試驗。取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液分別點于同一硅膠G板上，以二甲苯-乙酸乙酯（1:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2，4-二硝基苯肼乙醇試液，日光下檢視（見圖1 1A）；取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液分別點于同一硅膠G板上，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視（見圖1 1B）；取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液分別點于同一硅膠G板上，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%硫酸香草醛試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視（見圖1 1C）；取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液分別點于同一硅膠G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2，4-二硝基苯肼乙醇試液，日光下檢視（見圖1 2A）；取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液分別點于同一硅膠G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視（見圖1 2B）；取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液分別點于同一硅膠G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%硫酸香草醛試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視（見圖1 2C）；取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液分別點于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇（12∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2，4-二硝基苯肼乙醇試液，日光下檢視（見圖1 3A）；取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液分別點于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇（12∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視（見圖1 3B）；取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液分別點于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇（12∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%硫酸香草醛試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視（見圖1 3C）；取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液分別點于同一硅膠GF254板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光（254 nm）下檢視（見圖1 4D）。

通過不同供試品溶液制備方法考察、不同展開系統以及不同顯色方法考察，上述圖譜中，2B圖譜顯示最優。確定采用方法（1）制備供試品溶液，在硅膠G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑展開，噴以二硝基苯肼試液，在105 ℃下加熱至斑點明顯呈現，日光下檢視，所得熟地黃薄層色譜分離效果和顯色效果較佳，斑點清晰，且陰性對照無干擾，為最優薄層色譜條件。

2.1.6 點樣量考察

吸取供試品溶液各1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL點于同一張硅膠G薄層板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑展開，噴以二硝基苯肼試液，在105 ℃下加熱至斑點明顯呈現，日光下檢視。結果發現，點樣量為5 μL時，斑點清晰，分離效果好，1 μL、2 μL的斑點含量過低成像不清晰，10 μL、20 μL的斑點有明顯拖尾現象。故選擇點樣量為5 μL，見圖2。

圖2 點樣量考察薄層色譜圖

2.2 方法驗證

2.2.1 專屬性及精密度考察

分別吸取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液各5 μL點于硅膠G薄層板上，供試品溶液重復點樣6次，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑展開，噴以二硝基苯肼試液，在105 ℃下加熱至斑點明顯呈現，日光下檢視。結果表明，供試品中比移值（Rf）為0.41的棕黃色條帶和Rf為0.59的黃色條帶所呈現的顏色和位置與熟地黃對照藥材條帶一致，且陰性對照在主斑點位置處無干擾，表明該方法專屬性良好。同一供試品溶液重復點樣后，各斑點清晰，條帶顏色和位置一致，精密度良好，見圖3。

圖3 精密度考察薄層色譜圖

2.2.2 樣品驗證試驗

對11批不同廠家、批號的桂附地黃丸（濃縮丸）采用方法（1）分別制備供試品溶液，各吸取5 μL點于同一硅膠G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑展開，噴以二硝基苯肼試液，在105℃下加熱至斑點明顯呈現，日光下檢視。結果發現供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，斑點清晰，陰性對照無干擾，且分離效果和顯色效果均良好，見圖4。

圖4 不同批號樣品薄層色譜圖

3 結語

隨著人們生活方式的變化，腎陽疾病已經開始年輕化，而桂附地黃丸也是治療該類疾病的首選藥物之一，因此有必要加大對此品種的質量控制，以保證產品安全有效，為臨床安全用藥提供保障，為藥品監管提供技術支撐。而桂附地黃丸（濃縮丸）因劑型服用方便，使用廣泛，其質量評價尤為重要，本研究選擇藥方中君藥熟地黃，作為其質量控制的重要指標，對其真偽進行薄層鑒別。

對于桂附地黃丸（濃縮丸）中的熟地黃的鑒別，本研究對其薄層鑒別條件進行了詳細的考察，以熟地黃對照藥材為對照，在色譜系統中考察不同提取溶劑（乙酸乙酯，乙醇，水飽和正丁醇溶液），不同展開劑（二甲苯-乙酸乙酯，石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯，三氯甲烷-甲醇），不同顯色劑（2,4-二硝基苯肼乙醇試液，二硝基苯肼試液，2%硫酸香草醛試液），各點樣量（1 μL，2 μL，5 μL，10 μL，20 μL），及不同的檢視條件（日光下，105 ℃條件下加熱后日光下，紫外光（254 nm）下）對薄層色譜分析的影響，從而確定供試品溶液制備方法和最佳薄層色譜檢測條件，并在薄層色譜鑒別的方法學驗證中對其專屬性及精密度進行了考察及樣品驗證，最終確定薄層鑒別分析方法為采用乙酸乙酯提取樣品，在薄層色譜硅膠G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑展開，噴以二硝基苯肼試液，在105 ℃下加熱至斑點明顯呈現，日光下檢視，所得熟地黃薄層色譜分離效果和顯色效果較佳，斑點清晰、專屬性強、重現性好，且陰性對照無干擾。

綜上所述，本研究所建立的薄層色譜鑒別方法操作簡便易行，定性特征明顯、結果直觀，可有效鑒別桂附地黃丸（濃縮丸）中的熟地黃，可為桂附地黃丸（濃縮丸）的質量評價提供一定參考。