骨碎補總黃酮對iPS-MSCs成骨分化的影響

童夢莎 鄭陽 任聰林 林福 付坤飛 孫杭凱 吳子豪 全仁夫

1.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053

2.浙江中醫藥大學附屬江南醫院，浙江 杭州 312001

3.杭州市蕭山區中醫院，浙江 杭州 312001

到目前為止，修復骨缺損仍是臨床醫生面臨的一個巨大挑戰。目前臨床上多采用自體骨移植或同種異體骨移植，但是傳統方法存在供體部位發病率高及異體移植排異反應大等缺點，骨組織工程為骨缺損提供了新方法，其有3個要素：種子細胞、成骨誘導物和支架材料[1-2]。誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)來源的間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可作為新型組織工程骨的種子細胞，其作為種子細胞與骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)相比較更具有臨床意義[3-5]，它們提供了更連續的細胞供應且可以避免在臨床實踐中使用人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells，HESCs)所引起的倫理爭議[6]，有研究報道iPS-MSCs在動物應用中有很大治療潛能[7-9]。許多中草藥被證實有促骨愈合的作用[10-12]，其中骨碎補是較為常見的用于骨修復的中藥，大量研究表明骨碎補提取物可促進動物BMSCs或MC3T3-E1細胞系增殖及成骨分化，并且抑制破骨細胞的形成[13-16]，然而關于骨碎補總黃酮(total flavonoids of rhizoma drynariae，TFRD)干預iPS-MSCs增殖及成骨分化的報道并不多見。因此，本研究旨在研究骨碎補總黃酮對iPS-MSCs成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

iPS(課題組自備)；骨碎補提取物(購于南京道斯夫科技公司)；地塞米松(D1756)、β甘油磷酸鈉(G9422)、茜素紅(A5533)(均購于Sigma公司)；低糖DMEM培養基(11330057)、FBS(10099141)、GlutaMAXTM(100×)(30050087)、MEMNEAA(100×)(11140050)(均購于Gibco公司)；青鏈霉素混合液(P1400)(Solarbio公司)；多聚甲醛(上海潤捷化學試劑有限公司)；CCK-8檢測試劑盒(C0037)、ALP試劑盒(P0321 S)(均購于碧云天公司)；Trizol(12183555)(購于Invitrogen公司)；SYBRGreenPCR試劑盒(A25743)、逆轉錄試劑盒(K1691)(均購于Thermo公司)；酶標檢測儀(Thermo公司，MK-3)；Real-time檢測儀(ABI公司，ABI-7500)；倒置顯微鏡(Leica公司，DMIL)。

1.2 iPS誘導成MSCs

將IPS用Ⅳ型膠原酶于37 ℃、5%CO2培養箱中消化，后緩慢加入基礎培養基，沉降兩次后，加入MSC培養基重懸(含10%FBS、1%GlutaMAX、1%NEAA、雙抗、0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸、0.2 mmol/L VitC的低糖DMEM培養液)，將單懸液接種于預先用1%明膠包被1 h的培養皿中，誘導分化2周后，為純化MSCs樣細胞，進行傳代，一般培養至第4代后會出現形態相對一致的成纖維樣細胞，繼續培養至第7代以純化細胞，之后可用流式細胞儀鑒定細胞表面標志物。

1.3 骨碎補提取物中總黃酮含量檢測

取柚皮苷對照品適量，用甲醇稀釋成濃度為0.66、1.32、13.2、26.4、39.6、52.8 μg/mL的標準品溶液。用紫外/可見分光光度計在283 nm下測定各濃度標準液的吸光度(A)，其結果分別為0.030、0.046、0.371、0.697、0.972、1.297。

分析得TFRD含量標準品曲線方程：以吸光度(A)為縱坐標，濃度(μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線Y=0.024 2X+0.028 7，R=0.999 1，線性范圍為0.66～52.8 μg/mL，表明良好線形關系，結果見圖1。

圖1 標準曲線圖

取3份骨碎補提取物，每份16 mg。在283 nm波長下，測定吸光度值，結果見表1。

表1 骨碎補提取物中總黃酮含量

1.4 不同濃度骨碎補總黃酮培養基的制備

稱取不同量骨碎補總黃酮藥物，加入成骨誘導培養基中，制作成0、15.63、31.25、62.5、125、250 μg/mL的6個濃度的TFRD培養基，0 μg/mL的骨碎補總黃酮培養基作為空白對照組。

1.5 CCK8法檢測iPS-MSCs增殖

iPS-MSCs接種于24孔培養板，分別加入0、15.63、31.25、62.5、125、250 μg/mL TFRD培養基干預，每個檢測設3個復孔，分別干預24、48、72 h，去除培養基，加入10%CCK8溶液，于37 ℃，5%CO2環境下孵育1 h，吸取100 μL培養液至96孔培養板中，酶標儀以450 nm波長檢測。

1.6 ALP活性檢測及茜素紅染色定量分析

iPS-MSCs接種于相應培養板中培養，待細胞融合至80%左右時按增殖實驗結果選取相應濃度骨碎補總黃酮培養基進行誘導，誘導14 d后進行ALP活性檢測及茜素紅染色定量分析，細胞培養液按照ALP試劑盒方法酶標儀測定520 nm處吸光度值。4%多聚甲醛固定；用0.1%的茜素紅染液中染色30 min，于倒置顯微鏡下觀察拍照。茜素紅定量分析：用1 mL10%氯化十六烷吡啶室溫浸泡20 min，用560 nm的分光光度計檢測。

1.7 RT-PCR 檢測

iPS-MSCs誘導14 d后，采用Trizol試劑提取細胞總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書步驟進行逆轉錄，采用實時熒光PCR將獲取到的cDNA進行擴增，計算各組2-△△CT值，即為各組中基因的相對表達量，內參基因為GAPDH。實時熒光PCR擴增條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 2 s，共40個循環。各檢測基因引物序列見表2。

表2 RT-PCR目的基因引物序列

1.8 統計學分析

由SPSS 20.0軟件統計分析各數值間差異的顯著性，采用單因素方差分析和重復測量方差分析檢驗(Dunnett雙側檢驗)，以均數±標準差表示，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度TFRD對iPS-MSCs增殖的影響

發現 125、250 μg/mL 濃度的TFRD抑制 iPS-MSCs 增殖生長，故本實驗選用 0、15.63、31.25、62.5 μg/mL濃度干預 iPS-MSCs 的成骨分化。見圖2。

圖2 不同濃度骨碎補總黃酮干預iPS-MSCs增殖

2.2 ALP活性檢測及茜素紅染色定量分析

ALP活性檢測結果顯示15.63、31.25、62.5 μg/mL 3個濃度組的ALP活性均高于0 μg/mL對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)。其中31.25 μg/mL濃度組的ALP活性最好(圖3)；茜素紅染色顯示15.63、31.25、62.5 μg/mL 3個濃度組的礦化結節茜素紅染色的陽性面積和數量均高于0 μg/mL對照組。定量分析結果也顯示15.63、31.25、62.5 μg/mL 3個濃度組的礦化結節量高于0 μg/mL對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)。見圖4。

圖3 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測結果(**P<0.01)

圖4 茜素紅染色結果

2.3 TFRD對iPS-MSCs中成骨相關OCN、Collagen I mRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示 15.63、31.25、62.5 μg/mL 3個濃度組的 OCN、Collagen I mRNA 表達量均高于 0 μg/mL 對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)。見圖5。

圖5 骨碎補總黃酮干預14 d iPS-MSCs OCN 和 Collagen Ⅰ mRNA 表達情況(**P<0.01)

3 討論

骨組織工程最佳細胞來源的選擇和使用是一個具有挑戰性的問題，BMSCs是目前應用最廣泛的替代或再生受損骨組織的干細胞來源，但骨組織工程理想的細胞來源應該具有無免疫排斥反應、擴增迅速、數量功能充足及獲取方便且符合倫理的優點[17]。而iPSCs擴增能力強，在特定的誘導條件下能夠向人體各種體細胞進行分化，并有研究證明從iPS中獲得的MSCs具有安全的治療性基因整合，可以顯著降低腫瘤的發病率[18-20]，其能通過旁分泌發揮抗炎及營養作用[1]，且有大量研究證明iPS-MSCs在骨與軟骨再生的細胞治療具有極大潛力[21-23]。

《素問·陰陽應象大論》：“腎生骨髓。”中醫認為骨不愈因以補腎壯骨為治療原則。骨碎補味苦性溫，歸肝、腎經，TFRD為其中發揮藥理作用的主要活性物質，具有促骨修復、抗骨質疏松、抑制炎癥反應等作用[24]，且其毒副作用低。研究證明TFRD通過激活Wnt/β-catenin、BMP、Notch、Runx2等靶向信號通路，促進成骨細胞的增殖及分化，同時可以抑制巨噬細胞向破骨細胞分化，發揮抗骨質疏松及促骨折愈合的作用[25-28]。實驗研究報道TFRD可促進BMSCs向成骨細胞分化過程中ALP活性及礦化結節量，并增加OCN和Collagen I的表達[13,29-30]，可能通過上調兩者的表達去促進成骨，所以本實驗采用iPS-MSCs作為種子細胞，TFRD作為成骨誘導劑，研究TFRD對iPS-MSCs成骨分化影響，為骨組織工程中誘導骨重建的有效方法的發展提供理論支持。

本實驗從骨碎補中提取有效成份TFRD，經測定，該提取物中總黃酮含量近達95%。為了評估TFRD干預iPS-MSCs成骨分化的合適濃度，本研究選用0、15.63、31.25、62.5、125、250 μg/mLTFRD培養基，通過CCK8法檢測發現125、250 μg/mL濃度的TFRD抑制iPS-MSCs增殖生長，因此，本研究選用濃度低于62.5 μg/mL的TFRD干預iPS-MSCs的成骨分化。堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)、I型膠原(collagen I)及鈣結節是評估成骨分化的重要標志。其中ALP及鈣沉積在成骨分化早期即有表達，ALP通過將磷酸酯轉化為無機磷來促進骨基質礦化，鈣結節是礦化的重要標志[31-32]，結果顯示TFRD在0～31.25 μg/mL濃度內呈劑量依賴性地促進iPS-MSCs鈣結節形成以及增加ALP活性，RT-PCR檢測結果也證實，0～31.25 μg/mL濃度內呈劑量依賴性地促進OCN、Collagen I的基因表達，其中31.25 μg/mL濃度組的OCN、Collagen I的基因表達增加最明顯，而OCN和Collagen I都是成骨細胞分泌的細胞外基質蛋白，可刺激成骨細胞粘附與分化，是成骨分化晚期的重要標志[33-34]，進一步說明合適濃度的TFRD具有促進iPS-MSCs成骨分化的作用。

綜上所述，骨碎補總黃酮可能通過促成骨關鍵因子OCN和collagen I的表達促進iPS-MSCs向成骨細胞分化，iPS-MSCs有作為新型組織骨工程種子細胞的潛力，骨碎補有望成為天然的成骨誘導劑，下一步將用骨碎補總黃酮誘導分化iPS-MSCs于生物支架上作體外共培養研究。