歸芍方對鄰苯二甲酸二丁酯誘導的斑馬魚眼部細胞凋亡的影響*

李夢雨，華永慶，黃天一，鄭云楓，嚴國俊，程建明，袁曉琳

(南京中醫藥大學1.藥學院，2.江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心；3.中醫學院中西醫結合學院，南京 210023)

視疲勞是指由于各種病因使人眼視物時超過其視覺功能所能承載的負荷，導致用眼后出現視覺障礙、眼部不適或伴有全身癥狀等以至不能正常進行視作業的一組癥候群[1]。隨著信息化的發展以及人們生活方式的變化，視疲勞在各年齡群體中頗為常見，嚴重影響患者的生活質量[2]。過度使用的視覺顯示終端及環境污染等因素可引起眼部細胞氧化應激損傷，造成眼部細胞凋亡，導致眼部疾病的產生[3]。中醫學認為視疲勞屬“肝勞”范疇。臨床上根據本病病機肝腎兩虛、精血不足的特點，提出補益肝腎、益氣活血、通絡明目的治療原則，參照既往治療視疲勞經驗，擬歸芍方防治視疲勞。歸芍方源于元代倪維德之芎歸補血湯及現代陳達夫駐景丸加減方[4-5]，由當歸、白芍、川芎、枸杞和菟絲子等5味中藥組成，具有補益肝腎的功效，主治肝腎兩虛、兩目昏暗。臨床觀察發現歸芍方具有較好的緩解視疲勞作用，然而其確切的藥理效應尚待證實。

斑馬魚作為研究人類眼科疾病的模型之一[6]，其結構、組織成分和生物信號方面與其他脊椎動物相似，鑒于其實驗周期短、胚胎透明、頭部眼球占比較大的特點顯著優于兔、鼠、恒河猴等動物，已被逐漸應用于眼科相關疾病研究[7]。本研究采用斑馬魚眼部細胞凋亡模型對歸芍方在體藥理作用進行研究，同時，對可能引起藥理活性發生改變的不同提取方法與藥理作用間關系進行了研究，并對其作用機制進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 斑馬魚AB品系，購于凱基生物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(滬)2018-0004。飼養條件：晝夜節律，晝：夜=14 h：10 h；溫度(28.5 ± 0.5) ℃。飼養環境嚴格按照《江蘇省地方標準》實驗用斑馬魚飼養技術條件。實驗流程嚴格按照《實驗動物管理與使用指南》執行。

1.1.2藥品與試劑 藥材飲片：當歸(產地甘肅，批號：17071705)，炒白芍(產地安徽，批號：17091605)，川芎(產地四川，批號：17101814)，菟絲子(產地內蒙古，批號：17081605)，枸杞子(產地寧夏，批號：17102112)。

提取物：當歸提取物(批號：CDG-A-081908)，白芍提取物(批號：CBS-A-091802)，川芎提取物(批號：CCX-A-081109)，菟絲子提取物(批號：CTSZ-A-081118)，枸杞子提取物(批號：CGQ-A-081203)，以上提取物與藥材質量比均為1：10，均購于陜西嘉禾生物科技股份有限公司。人參皂苷(ginsenoside，Rg1，含量≥98%，批號：B21057)，鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP；含量> 99.5%，批號：S51140)，鏈酶蛋白酶E(批號：721J041)、吖啶橙染液均購自上海源葉生物科技有限公司；MS-222(Acros Organics，批號：A0288328)。

1.1.3實驗儀器 Leica體式熒光顯微鏡(Leica公司，型號：M205FA)；生化培養箱(上海躍進醫療器械有限公司，型號：SPX-150)；酶標儀(Bio-Tek公司，型號：SyneRgy2)；凝膠電泳儀(BIO-RAD公司，型號：1658033)；定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀(Applied Biosystems公司，型號：7500)。

1.2方法

1.2.1藥物溶液的配制 歸芍方研究用樣品的制備。 ①歸芍方組成：當歸、炒白芍各10 g，川芎、菟絲子、枸杞子各8 g。②歸芍方藥材飲片水提取物(Chinese material medicine extract，ME，批號：20180523)：按歸芍方，加水提取2次(7倍，5倍)，每次提取1.5 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至含生藥量0.1 g·mL-1，即得。③歸芍方藥材水提醇沉提取物(Chinese material medicine extract alcohol precipitation treatment，MEA，批號：20180523)：按歸芍方，加水提取2次(7倍，5倍)，每次提取1.5 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1 g·mL-1，加乙醇至含醇量60%，放置24 h，濾過，濾液減壓濃縮至含生藥量0.1 g·mL-1，即得。④歸芍方提取物配方(Chinese medicine extract powder solution，PS，批號：20180502)：按歸芍方，按比例取各藥味提取物，加水制備成含生藥量0.1 g·mL-1的溶液，即得。上述歸芍方提取物采用高效液相色譜(HPLC)法，對不同提取方式樣品中的關鍵質量指標芍藥苷、阿魏酸進行了含量測定，以保證不同提取方式樣品的質量相對均一。

胚胎培養液配制：量取純水1000 mL，加氯化鈉溶液調節電導率至550～580 μS·cm-1，然后加入0.1 mg·mL-1亞甲藍溶液1 mL，混合均勻，即得。

DBP溶液配制：稱取適量DBP，加入胚胎培養基混勻，得10 mmol·L-1DBP儲備液，使用時稀釋至所需濃度即可。

1.2.2存活率檢測 將挑選好的正常胚胎置于24孔板中，每孔12枚，分為5組，平行3次，加入胚胎培養基1.5 mL，從受精后30 h開始加入各濃度藥物(0，10，102，103，104μg·mL-1)1.5 mL，于給藥24 和48 h觀察胚胎存活數目，數據匯總后統計存活率。

1.2.3給藥方法 參照本課題組前述方法進行[8]，將正常斑馬魚胚胎置于3塊6孔板中，給予胚胎培養基2 mL，飼養至受精后30 h，吸盡培養基；正常對照組每孔加入胚胎培養基2 mL，模型對照組每孔加入10 μmol·L-1DBP2 mL，給藥組每孔除加入20 μmol·L-1DBP1 mL外分別加入 ME、PS、MEA(200，100和20 μg·mL-1)1 mL，飼養18 h。吖啶橙染色并在體式顯微鏡下觀察眼部凋亡細胞，采集圖片并進行數據處理。

1.2.4圖片采集及數據處理 將胚胎放入有0.5 mg·mL-1蛋白酶E溶液的培養皿中，在室溫下放置8 min；當胚胎有個別開始脫膜時，立即加入胚胎培養液稀釋終止脫膜，迅速將脫膜后的胚胎移入干凈的培養皿中，漂洗2次后，用5 μg·mL-1吖啶橙在暗室中染色1 h，接著用胚胎培養液漂洗3次，每次5 min，然后用0.04 mg·mL-1MS-222 溶液1 mL 麻醉5 min，置載玻片上于熒光顯微鏡下鏡檢攝像，眼部凋亡細胞呈綠色熒光，采用Image J軟件對斑馬魚眼部凋亡細胞數進行統計。

1.2.5免疫印跡(Western blotting)法檢測凋亡相關基因Bcl-2蛋白的表達量 收集給藥結束后斑馬魚胚胎，提取蛋白，二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid，BCA) 法測定蛋白濃度。免疫印跡法測定Bcl-2蛋白的表達量。Bcl-2一抗(稀釋比例1：1000)，4 ℃孵育過夜。常溫搖床孵育兔二抗1 h，于數字化凝膠成像工作站曝光，Image Lab灰度值統計分析，根據凝膠成像結果檢測Bcl-2蛋白表達量。

1.2.6實時熒光定量PCR檢測線粒體mtDNA 拷貝數的變化 本實驗選擇線粒體mtDNA上的mt-cytb作為目的基因，單拷貝基因核基因GAPDH作為內參。所使用的引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列 Tab.1 Sequences of primers

收集給藥結束后斑馬魚，漂洗結束后將幼魚分組吸入無酶EP管中，按照DNA快速抽提試劑盒說明書提取總DNA，稀釋DNA樣本至終濃度20 ng·μL-1。然后使用實時熒光定量PCR儀對線粒體mtDNA上的mt-cytb基因以及單拷貝核基因GAPDH進行定量，每組各3 個平行樣本。反應結束后通過溶解曲線分析確定產物的特異性。采用2- ΔΔCt對PCR結果進行相對定量分析。其中線粒體DNA拷貝數(mitochondrial DNA copy number，mtDNAcn)表示為mt-cytb基因與GAPDH基因表達的相對比值。

2 結果

2.1不同制備工藝歸芍方對斑馬魚存活率的影響 歸芍方不同提取物對斑馬魚存活率的影響，結果見圖1。給藥24 h后，104μg·mL-1MEA、PS顯著降低斑馬魚胚胎存活率(P<0.01)；給藥時間延長至48 h后，104μg·mL-1ME及103μg·mL-1PS開始表現出明顯的胚胎致死性(P<0.01)。其余濃度藥物給藥24 及48 h對胚胎存活率無顯著影響。

2.2不同制備工藝歸芍方對斑馬魚眼部細胞凋亡的影響 結合存活率實驗結果，采用無顯著影響的100 μg·mL-1及其以下濃度的歸芍方提取物來探究對斑馬魚眼部細胞凋亡的影響。在受精后30 h的斑馬魚培養基中加入10 μmol·L-1DBP與不同濃度ME、MEA、PS(10，50，100 μg·mL-1)共培養18 h。結果見圖2。與正常對照組比較，模型對照組斑馬魚眼部細胞凋亡數目顯著增加(P<0.01)。與模型對照組比較，1 μmol·L-1人參皂苷Rg1組斑馬魚眼部細胞凋亡數目顯著降低(P<0.01)；10 μg·mL-1MEA和PS組斑馬魚眼部細胞凋亡數目顯著降低(P<0.01)；100 μg·mL-1ME及中、高濃度MEA、PS組斑馬魚眼部細胞凋亡數目均顯著降低(P<0.01)。提示3種歸芍方提取物均能拮抗斑馬魚眼部細胞凋亡，且與ME組比較，PS和MEA組抗眼部細胞凋亡作用更為顯著。

①與48 h對照組比較，t=10.960～42.750，P<0.01；②與104 μg·mL-1ME(24 h)組比較，t=17.330，P<0.01；③與24 h 對照組比較，t=13.860，17.320，P<0.01；④與104 μg·mL-1 MEA(24 h)組比較，t=8.573，P<0.01；⑤與103 μg·mL-1 PS(24 h)組比較，t=8.552，P<0.01；⑥與104 μg·mL-1 PS(24 h)組比較，t=10.960，P<0.01。圖1 不同制備工藝歸芍方對斑馬魚存活率的影響①Compared with control group at 48 h，t=10.960—42.750，P<0.01；②Compared with 104 μg·mL-1 ME(24 h) group，t=17.330，P<0.01；③Compared with control group at 24 h，t=13.860，17.320，P<0.01；④Compared with 104 μg·mL-1 MEA(24 h) group，t=8.573，P<0.01；⑤Compared with 103 μg·mL-1 PS(24 h) group，t=8.552，P<0.01；⑥Compared with 104 μg·mL-1 PS(24 h) group，t=10.960，P<0.01.Fig.1 Effects of Guishao formula with different preparation processes on the survival rate of

2.3歸芍方對斑馬魚胚胎凋亡相關基因Bcl-2蛋白表達的影響 結果見圖3。與正常對照組比較，模型對照組Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)。與模型對照組比較，人參皂苷Rg1組Bcl-2蛋白表達水平顯著提高(P<0.01)。與模型對照組比較，中、高濃度歸芍方顯著增加Bcl-2蛋白表達量(P<0.05，P<0.01)。結果表明，歸芍方能夠有效提高DBP損傷后模型斑馬魚細胞凋亡相關Bcl-2蛋白的表達，從而有效抑制細胞凋亡。

2.4歸芍方對斑馬魚胚胎線粒體mtDNA拷貝數的影響 結果見圖4，與正常對照組比較，模型對照組線粒體mtDNA拷貝數顯著降低(P<0.01)，給予不同濃度歸芍方后，線粒體mtDNA拷貝數均呈上升趨勢，其中100 μg·mL-1劑量組與模型對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。結果表明，歸芍方能夠有效升高凋亡細胞線粒體mtDNA拷貝數，對線粒體功能具有保護作用。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.人參皂苷Rg1組；D.10 μg·mL-1ME組；E.50 μg·mL-1ME組；F.100 μg·mL-1ME組；G.10 μg·mL-1MEA組；H.50 μg·mL-1MEA組；I.100 μg·mL-1MEA組；J.10 μg·mL-1 PS組；K.50 μg·mL-1 PS組；L.100 μg·mL-1 PS組；①與正常對照組比較，t=12.910，P<0.01；②與模型對照組比較，t=4.418～17.600，P<0.01；③與模型對照組比較，t=3.615，P<0.05。圖2 不同制備工藝歸芍方對斑馬魚眼部細胞凋亡的影響A.normal control group；B. model control group；C.ginsenosides Rg1 group；D.10 μg·mL-1 ME group；E.50 μg·mL-1 ME group；F.100 μg·mL-1 ME group；G.10 μg·mL-1 MEA group；H.50 μg·mL-1 MEA group；I.100 μg·mL-1 MEA group；J.10 μg·mL-1 PS group；K.50 μg·mL-1 PS group；L.100 μg·mL-1 PS group.①Compared with normal control group，t=12.910，P<0.01；②Compared with model control group，t=4.418—17.600，P<0.01；③Compared with model control group，t=3.615，P<0.05.

A.正常對照組；B.模型對照組；C.人參皂苷Rg1組；D.10 μg·mL-1歸芍方組；E.50 μg·mL-1歸芍方組；F.100 μg·mL-1歸芍方組；①與正常對照組比較，t=8.28，P<0.01；②與模型對照組比較，t=3.98，4.46，P<0.01；③與模型對照組比較，t=3.67，P<0.05。圖3 不同制備工藝歸芍方對斑馬魚Bcl-2蛋白表達的影響A.normal control group；B.model control group；C.ginsenosides Rg1 group；D.10 μg·mL-1 Guishao formula group；E.50 μg·mL-1 Guishao formula group；F.100 μg·mL-1 Guishao formula group；①Compared with normal control group，t=8.28，P<0.01；②Compared with model control group，t=3.98，4.46，P<0.01；③Compared with model control group，t=3.67，P<0.05.

3 討論

“肝勞”一詞最早見于唐朝孫思邈之《千金要方》，“讀書、博弈過度而傷目者，謂肝勞”。視疲勞關鍵之病機為肝腎兩虛，精血不足[9]。肝在體為目，在臟與肝、脾、腎密切相關，故提出“補益肝腎、益氣活血、通絡明目”的治療原則，擬定抗視疲勞歸芍方。方中當歸、白芍為君藥，補血活血，養血平肝；川芎活血行氣為臣；枸杞益精明目為佐；菟絲子養肝明目為使。整方配伍重在整體調節，補益氣血，明目通絡，又滋而不膩，補而不滯。本研究對“養血平肝”見長的歸芍方緩解視疲勞的藥效進行了考察，結果表明歸芍方能夠有效改善模型斑馬魚眼部細胞凋亡，為歸芍方臨床應用提供了實驗依據。

斑馬魚作為一種便捷高效的體內模型[10-11]，其胚胎發育迅速，易于形態學觀察，已逐漸被應用于中藥藥效學研究[12]。斑馬魚與人類基因高度同源，基因相似度高達87%[13-14]。課題組前期建立DBP誘導斑馬魚眼部細胞凋亡模型[8]，具備高效、穩定等特點。本研究利用該模型對歸芍方3種不同提取物及不同濃度對斑馬魚眼部細胞的保護作用進行考察。結果顯示ME、MEA和PS在較高濃度下均對斑馬魚眼部細胞具有保護作用；濃度降低后MEA和PS仍具有顯著抗凋亡作用。上述研究表明，本方標準化藥材飲片配方與藥材水提醇沉提取物具有相似活性，藥材水提物經醇沉后，效應成分并未丟失，且可能去除一些干擾性成分[15]。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.人參皂苷組；D.10 μg·mL-1歸芍方組；E.50 μg·mL-1歸芍方組；F.100 μg·mL-1歸芍方組；①與正常對照組比較，t=10.98，P<0.01；②與模型對照組比較，t=7.55，P< 0.01圖4 歸芍方對斑馬魚胚胎線粒體mtDNA拷貝數的影響A.normal control group；B. model control group；C.ginsenosides Rg1 group；D.10 μg·mL-1 Guishao formula group；E.50 μg·mL-1 Guishao formula group；F.100 μg·mL-1 Guishao formula group；①Compared with normal control group，t=10.98，P<0.01；②Compared with model control group，t=7.55，P< 0.01.

視疲勞發病機制與過度用眼，活性氧積累引起氧化應激水平升高造成眼部細胞凋亡相關[16]。本研究發現，歸芍方能夠顯著上調模型斑馬魚抗凋亡蛋白Bcl-2表達量，發揮抗細胞凋亡作用。線粒體功能對維持細胞生命活動發揮重要作用，與細胞凋亡過程密切相關[17]。mtDNA是線粒體內獨立的一種雙鏈DNA，是決定線粒體功能的重要因素之一[18]。mtDNA拷貝數的變化能夠影響多種疾病的發生發展。本研究表明，歸芍方能夠有效提高線粒體mtDNA拷貝數，保護線粒體功能，該途徑可能與其發揮抗細胞凋亡作用相關。

綜上所述，歸芍方具有顯著的抗模型斑馬魚眼部細胞凋亡的作用。采用DBP誘導斑馬魚眼部細胞凋亡模型，對于中藥復方及不同提取物藥效評價具有靈敏、高效等特點。本研究為歸芍方臨床應用提供了實驗依據，可為其進一步研究提供參考。