糞菌移植對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠腦-腸軸中5-HT信號通路的影響

歐陽勇文，李兆滔，呂 晉，趙光華，王藝霖，崔西玉△

佛山市第一人民醫院：1.消化內科；2.病理科；3.檢驗科，廣東佛山 528000

腸易激綜合征(IBS)是一種間歇性或持續性發作、以腹痛、便秘、腹瀉為主要特征的腸功能紊亂性疾病[1-2]。根據IBS的癥狀表現，可分為便秘型、腹瀉型(IBS-D)、不定型及混合型，其中IBS-D發病率最高[3-4]。由于其頻繁、持續的發作，給患者帶來嚴重的心理障礙、精神異常及經濟負擔。目前研究認為，IBS-D致病原因主要包括腸道菌落失衡、飲食不規律、內臟高敏感性、感染及腦-腸互動異常等多種因素，其中腸道菌群失衡是IBS-D發生的關鍵因素之一[5-7]。有研究顯示，IBS-D患者與健康人群的糞便菌群存在明顯的差異，且菌群分布及功能呈現紊亂狀態。因此，調節腸道菌群平衡成為治療IBS-D的重要研究方向[8]。糞菌移植(FMT)是指將健康供體的糞便菌液通過一定的方式處理后，移植到患者的胃腸道中，通過調節其患者腸道內腸道菌落，重建正常微生態平衡，從而達到治療作用[9-10]。目前已有研究證實，糞菌移植在改善IBS-D患者癥狀中具有明顯的治療效果[11]，但其作用機制尚不明確。因此，本研究通過構建IBS-D模型大鼠，圍繞腦-腸軸5-HT信號通路，探討糞菌移植的作用機制，為臨床糞便移植的推廣使用及新藥開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠45只，體重(130±20)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號[SCXK(京)2018-0002]，飼養于實驗動物中心，在溫度(23±3)℃，光暗12 h/12 h條件下適應性喂養。

1.2試劑 SERT抗體(美國CST公司，批號：7473218)、TPH1抗體(美國CST公司，批號：6802487)、5-HT3R抗體(英國Abcam公司，批號：ab13897)、5-HT4R抗體(英國Abcam公司，批號：ab60359)，5-HT和SP酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?，批號：607783、789981)；辣根酶標記熒光二抗(福麥斯有限公司，批號：1125854)，3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑及電泳液等(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3糞菌液的制備 參考陳夢等[12]制備方法，收集健康大鼠新鮮糞便，置于無菌管中，按照質量/體積1∶5的比例加入生理鹽水，充分混合搖勻后，在濾網中過濾，除去大顆粒物質，將濾液3 000 r/min離心10 min，棄上清，再次加入生理鹽水，重復上述步驟3次，收集沉淀物，加入生理鹽水重懸，即獲得糞菌液。

1.4動物分組及模型的制備 將SD大鼠按照隨機數字表法分成3組，正常組、模型組及糞菌移植組，每組15只。除正常組外，其他組均進行造模。造模方法如下：采用番瀉葉(20 mg/kg)對大鼠進行灌胃，每天2次，同時在每次灌胃后1 h，將大鼠的胸部、前肢及肩部采用透明膠帶進行束縛，使其不能行動，誘導大鼠出現躁狂的狀態，從而對大鼠造成一定程度的應激刺激，每次束縛2 h，造模時間為連續14 d。造模完成后，采用腹壁撤離反射(AWR)評分標準對模型進行驗證，評分達到3分即表示造模成功。造模完成后，對糞菌移植組大鼠采用預先制備好的糞菌液灌腸處理，每次灌腸體積2 mL，對照組和模型組均采用同樣的灌腸方法給予灌腸生理鹽水，連續灌腸治療10 d。

1.5標本采集 于大鼠末次糞菌移植治療后，禁食12 h，乙醚麻醉，股動脈取血，頸椎脫臼法處死，待血液靜置30 min后，3 000 r/min離心5 min，分離血清，分裝后置于-80 ℃冰箱中備用。同時迅速取出大鼠腦組織和距離肛門3～5 cm 處的新鮮結腸組織(長度1～2 cm)，生理鹽水沖洗干凈后，一部分置于10%甲醛溶液中固定，其他部分置于-80 ℃冰箱中備用。

1.6觀察指標

1.6.1基本情況 觀察SD大鼠在治療期間糞便顏色、氣味、性狀、腹瀉程度、精神狀態及進食狀況等。

1.6.2糞便含水量 采集同時間段各組大鼠的糞便，稱質量后記作濕重，干燥后再稱質量記為干重，計算治療前后各組大鼠糞便含水量的變化。糞便含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6.3大鼠腦組織及血清5-HT和SP表達水平 取部分大鼠腦組織，按照一定比例加入生理鹽水，在冰上研磨，制成勻漿，3 000 r/min離心3 min，收集上清備用。從冰箱中取出大鼠血清，復溫，采用ELISA檢測大鼠腦組織及血清5-HT和SP表達水平，檢測步驟嚴格依據ELISA試劑盒說明書開展。

1.6.4大鼠結腸組織及腦組織SERT蛋白表達水平 采用免疫組化法檢測大鼠結腸及腦組織SERT蛋白表達水平。取出于甲醛溶液中固定好的大鼠結腸組織和腦組織，將其制作成蠟塊，切片，將切片置于二甲苯溶液中脫蠟，在不同濃度梯度的乙醇溶液中水化，取出切片后，置于檸檬酸緩沖液中10 min進行抗原修復，滴加H2O2溶液封閉，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗 3次，每次1 min，加入抗體(1∶100)，于4 ℃搖床條件下孵育過夜，PBS清洗清洗 3次，每次1 min，滴加二抗，37 ℃孵育2 h，PBS清洗 3次，每次1 min，加入DAB染色，將切片置于梯度濃度的二甲苯和乙醇溶液中脫水，干燥后封片，置于高倍顯微鏡下觀察，隨機選取3個視野，觀察蛋白表達情況。

1.6.5大鼠結腸組織和腦組織SERT、THP1、5-HT3R、5-HT4R蛋白表達水平 采用Western blot法檢測大鼠結腸組織和腦組織SERT、THP1、5-HT3R、5-HT4R蛋白表達水平。選取各組大鼠結腸組織并進行稱量，按照比例加入裂解液提取組織蛋白，BCA法測定裂解液中蛋白濃度，依據測定的蛋白濃度按照比例加入上樣緩沖液，置于沸水中煮沸10 min使蛋白變性，獲取本后置于-20 ℃冰箱中備用。配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，組織樣本上樣，電泳，轉膜。然后，取出PVDF膜，置于37 ℃搖床中用脫脂奶粉封閉2 h，取出PVDF膜，TPBS沖洗3次，每次5 min，PBS清洗1次，每次3 min，滴加一抗(1∶100)，4 ℃搖床中孵育過夜，TPBS沖洗3次，每次5 min，PBS沖洗1次，每次3 min，置于37 ℃搖床中孵育二抗(1∶50 000)2 h，沖洗，配置顯影液后均勻涂抹于PVDF膜上，掃描目的蛋白，采用Image-Pro Plus軟件分析蛋白表達水平。

2 結 果

2.1大鼠基本情況 治療期間，所有大鼠均未發生死亡事件。正常組大鼠飲食、排便狀況、機體活動，以及生長狀況均表現正常；模型組大鼠在造模后，出現稀便樣腹瀉、精神狀況萎靡、飲水量增加、進食量減少，以及煩躁不安等癥狀；糞菌移植組大鼠在治療后，精神狀況明顯改善，腹瀉狀況明顯好轉。

2.23組大鼠糞便含水量比較 模型組大鼠糞便含水量明顯高于正常組，糞菌移植組大鼠糞便含水量明顯低于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

2.33組大鼠腦組織及血清5-HT和SP表達水平比較 與正常組相比，模型組大鼠腦組織和血清5-HT和SP表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，糞菌移植組大鼠腦組織和血清5-HT和SP表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 3組大鼠腦組織及血清5-HT和SP表達水平比較

2.43組大鼠結腸組織及腦組織SERT蛋白表達水平比較 與正常相比，模型組大鼠結腸組織及腦組織SERT蛋白表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，糞菌移植組大鼠在糞菌移植治療后結腸組織及腦組織SERT蛋白表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

注：免疫組化結果(×200)。

2.53組大鼠結腸組織和腦組織SERT、THP1、5-HT3R、5-HT4R蛋白表達水平比較 與正常組相比，模型組大鼠結腸組織和腦組織SERT、5-HT4R蛋白表達水平明顯降低，THP1和5-HT3R蛋白表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，糞菌移植組能SERT、5-HT4R蛋白表達水平明顯升高，THP1和5-HT3R蛋白表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖3、4。

注：A為Western blot檢測結果；B～E為相對表達量統計分析結果；與正常組比較，aP<0.01；與糞菌移植組比較，bP<0.01。

注：A為Western blot檢測結果；B～E為相對表達量統計分析結果；與正常組比較，aP<0.01；與糞菌移植組比較，bP<0.01。

3 討 論

IBS-D是一種常見的以腹瀉、腹痛等癥狀的消化系統疾病。目前，臨床上對IBS-D患者的治療方案主要為5-HT受體拮抗劑、選擇性5-HT再攝取抑制劑、解痙劑及止瀉藥等藥物治療，雖然有一定療效，但是停藥后容易復發，其應用有一定局限性[13-15]。近年來，FMT在調節胃腸道、改善IBS-D癥狀方面表現出明顯的療效，但其作用機制尚無統一的結論。因此，本研究旨在探討FMT對IBS-D的治療效果及作用機制，為臨床治療提供指導。本研究通過構建IBS-D模型大鼠發現，與模型組相比，FMT能夠明顯改善大鼠精神狀態、飲食及腹瀉等癥狀，提示FMT在IBS-D治療中有明顯的療效。

隨著消化系統及神經病理學等基礎研究的發展，腦-腸軸學理論越來越受到廣泛關注。有研究指出，IBS-D的發病機制主要由中樞神經系統和胃腸道神經系統相互協調，共同調節內臟敏感性和胃腸動力，其中腦腸肽(如5-HT、SP)在起到中間樞紐的作用[16-17]。5-HT是廣泛分布于中樞神經系統和胃腸系統中一種常見的腦腸肽，具有多種生理功能，在中樞神經系統中，5-HT的分泌異常能夠影響情緒狀態，增加不安狀態，同時也是作為一種內源性鎮痛物質，降低疼痛的敏感性[18]；在胃腸系統中，5-HT參與胃腸道蠕動、炎癥分泌等多種功能[19]。5-HT在機體中的合成及與受體間的結合異常會引起胃腸系統和中樞神經系統發生相應的改變[20]。其中，SERT和色氨酸羥化酶1(TPH1)在5-HT的合成及轉運過程中起重要作用。SERT是一種廣泛分布于胃腸道細胞膜和神經系統中的跨膜轉運蛋白，5-HT發揮作用后，會被SERT轉運蛋白轉運至細胞內失活，進而降低細胞外液中5-HT的濃度[21-22]；而TPH1是一種限速酶，在5-HT合成過程中發揮關鍵作用，TPH1表達水平升高，會明顯升高腸道或中樞神經系統5-HT水平[23-24]。既往有研究指出，胃腸道及中樞神經系統中SERT低表達和TPH1的高表達會明顯升高胃腸道或中樞神經系統5-HT水平，從而導致胃腸功能異常及內臟敏感性升高，表現出腹瀉、腹痛等不適癥狀，這可能是誘發IBS-D發病的原因[25]。本研究結果顯示，經糞菌移植治療后，大鼠結腸組織中SERT蛋白表達水平明顯升高，而TPH1蛋白表達水平明顯降低，且血清5-HT水平明顯降低，提示糞菌移植可能是通過抑制TPH1并增強SERT的表達來影響5-HT的合成與攝取，進而調節IBS-D腸道5-HT水平，發揮改善IBS-D大鼠胃腸動力的作用。此外，進一步研究大鼠腦組織相關5-HT信號通路發現，THP1和SERT蛋白的表達趨勢與結腸組織一致。究其原因可能在于糞菌移植通過改善胃腸道功能，間接性調控腦組織5-HT信號通路中蛋白的表達，進而改善內臟敏感性及焦慮、抑郁等應激狀態。

5-HT發揮生理作用是與其對應的受體結合介導的，其中5-HT3R和5-HT4R與IBS-D關系最為密切。5-HT3R在傳遞腦-腸軸中胃腸動力和內臟敏感性方面發揮重要作用，5-HT與5-HT3R結合能夠升高內臟敏感性，導致IBS-D等胃腸不適狀態[26]，而激活5-HT4R受體能夠促進乙酰膽堿等物質的釋放，從而影響胃腸蠕動及舒張[27]。5-HT3R和5-HT4R表達水平的變化均能影響IBS-D胃腸功能及改變內臟敏感性[28-29]。本研究結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠中腦組織及結腸組織5-HT3R表達水平明顯升高，5-HT4R表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，糞菌移植組5-HT3R表達明顯降低，5-HT4R的表達明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)。這表明影響5-HT與其受體的結合也是糞菌移植發揮作用的重要機制。

綜上所述，5-HT在體內的合成、重攝取，以及與其受體結合受到影響均會導致5-HT信號通路傳遞異常，進而誘發IBS-D的發生。糞菌移植能夠明顯改善的IBS-D的不適癥狀，其機制可能與調控腦-腸軸5-HT信號通路有關。