HBV感染者血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平與疾病進展的相關(guān)性*

向 焰，向 婷，張正娟，李 溶

廣元市精神衛(wèi)生中心檢驗科，四川廣元 628000

乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界上一個非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。目前，全世界約有2.5億HBV感染者，HBV感染后如果不及時治療，會造成肝細胞反復(fù)損傷，逐漸發(fā)展為慢性乙型肝炎(CHB)，增加肝硬化和肝癌的風(fēng)險，嚴(yán)重威脅患者的生命安全和健康[1]。肝活檢是診斷乙型肝炎肝硬化的金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有侵入性和無法重復(fù)檢查的缺點，在疾病監(jiān)測和療效評定方面有一定的局限性[2]。傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查對乙型肝炎肝硬化的早期診斷價值較低，對晚期出現(xiàn)并發(fā)癥患者往往具有較高的敏感性和特異性，但延誤了最佳治療時機[3]。血清學(xué)指標(biāo)具有檢測方便、快速、廉價等優(yōu)點，受到臨床研究者的高度關(guān)注[4]。巨噬細胞是肝臟炎性反應(yīng)的主要效應(yīng)細胞，能調(diào)節(jié)、聚集和激活肝星狀細胞。巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)，參與肝硬化的病理過程[5]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)是人類細胞中含量最多的甲基轉(zhuǎn)移酶，能維持DNA甲基化；DNMT1的異常表達會破壞基因組的穩(wěn)定性，在許多疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[6]。程序性死亡受體1(PD-1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種相對分子質(zhì)量為55 000的Ⅰ型跨膜蛋白，其是CD28家族的一員，能與程序性死亡配體-1結(jié)合，阻斷CD28介導(dǎo)的磷酸肌醇-3激酶途徑的激活，進而抑制T細胞的增殖和分化，降低T細胞的功能[7]。本文擬分析不同疾病進展期HBV感染者血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平差異及其相關(guān)性，旨在為臨床診斷和治療HBV感染提供新的方法和參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2019年1月至2020年1月收治的108例HBV感染者作為研究對象，根據(jù)肝組織病理檢查結(jié)果判斷CHB的嚴(yán)重程度，并將其分為A組(無癥狀HBV攜帶者)20例，B組(輕中度CHB)42例，C組(重度CHB)16例，D組(乙型肝炎肝硬化)30例。另選取同期行健康體檢的30例健康人作為對照組。HBV感染者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[8]中CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)一般資料完整；(3)存在乙型肝炎病史；(4)大于半年的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：肝功能指標(biāo)正常且乙型肝炎表面抗體(HBsAb)陽性，其余HBV血清學(xué)標(biāo)志物及HBV基因檢測結(jié)果均無異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他類型病毒性肝炎；(2)存在酒精、藥物和自身免疫性肝病；(3)合并肝臟良、惡性腫瘤；(4)合并嚴(yán)重心、肺、腎等其他臟器疾病；(5)合并其他部位惡性腫瘤。各組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象對本研究知情同意并簽署知情同意書。

表1 各組一般資料比較

1.2方法

1.2.1M-CSF檢測 空腹采集各組患者肘靜脈血5 mL，靜置30 min，采用上海盧湘儀離心機儀器有限公司提供的TG20.5臺式高速大容量離心機離心，取上清液，分別置于無菌、無RNA酶的離心管，然后于-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)錅y。采用AutoLumo A1000全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，以放射免疫法檢測血清M-CSF水平，試劑盒購自上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司。

1.2.2DNMT1檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組受試者血清DNMT1水平。采用純化的人DNMT1抗體包被微孔板，將DNMT1加入包被的微孔板中，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的DNMT1抗體結(jié)合形成抗體-抗原-酶標(biāo)記的抗體復(fù)合物，加入底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺，3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺在辣根過氧化物酶催化下呈藍色，在酸的作用下液體呈黃色，顏色深淺與DNMT1水平呈正比。用微孔板讀卡器測量450 nm處的吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算DNMT1水平。

1.2.3PD-1檢測 取各組受檢者的新鮮乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，加入PD-1單克隆抗體或相應(yīng)的同型對照抗體(上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司)，于4 ℃避光孵育20 min，然后添加500 μL的紅細胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司)，再于4 ℃避光孵育10 min，并添加1 000 μL磷酸鹽緩沖液，500×g離心5 min，洗滌后用流式細胞儀(常州必達科生物科技有限公司)檢測血清PD-1水平。

2 結(jié) 果

2.1各組血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平比較 血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平由高到低依次為D組、C組、B組、A組、對照組，各組血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平比較

2.2HBV感染者血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平與疾病進展的相關(guān)性 以疾病進展(定義：“A組”=1，“B組”=2，“C組”=3，“D組”=4)作為因變量，將各組感染者血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平作為自變量，納入多元線性回歸模型，結(jié)果顯示，血清DNMT1和PD-1水平均與HBV感染者疾病進展存在相關(guān)性(P<0.001)。見表3。

表3 HBV感染者血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平與疾病進展的相關(guān)性

3 討 論

CHB是由HBV長期反復(fù)作用引起的彌漫性肝損傷，大量炎性單核細胞聚集在肝臟，進一步分化為促纖維化的巨噬細胞，誘導(dǎo)肝星狀細胞、肝巨噬細胞和胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，打破基質(zhì)產(chǎn)生與降解的平衡，使其在肝臟中積聚，最終涉及多個系統(tǒng)受累，使肝臟變形硬化，進展為肝硬化[9]。乙型肝炎肝硬化早期的主要病變是肝纖維化，是對肝損傷的應(yīng)激性愈合反應(yīng)，肝臟結(jié)締組織的增生和沉積是非常普遍的現(xiàn)象。在長期的臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎肝硬化患者的病情程度存在很大差異，一般早期僅出現(xiàn)厭食、身體乏力、肝功能異常等癥狀，至晚期才出現(xiàn)腹水、門脈高壓、肝性腦病等并發(fā)癥[10]。因此，及時診斷CHB非常重要，臨床上需綜合、精準(zhǔn)地判斷CHB病情，為患者及時治療和改善預(yù)后提供參考依據(jù)。

M-CSF是由單核-巨噬細胞、成纖維細胞、成骨細胞和血管內(nèi)皮細胞分泌的細胞因子，其能通過與其受體調(diào)節(jié)單核-巨噬細胞系細胞的分化和增殖。M-CSF作為一種促炎因子，參與了炎性反應(yīng)。M-CSF表達升高可激活基質(zhì)金屬蛋白酶，促進膠原纖維的沉積，促進炎癥因子在肝臟的浸潤；M-CSF能抑制自然殺傷細胞合成和分泌抗纖維蛋白，可減少肝星狀細胞凋亡，促進肝硬化的進展[11]。DNA甲基化是一種非常重要的表觀遺傳修飾形式，其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是DNA甲基化的關(guān)鍵調(diào)控因子，DNMT1屬于一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。DNMT1在乙型肝炎中的作用已引起廣泛關(guān)注。DNMT的表達與HBV感染密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，HBV X蛋白的轉(zhuǎn)錄激活DNMT1啟動子，進而上調(diào)DNMT1的表達，DNMT1在CHB患者中過度表達。此外，DNMT1還可以調(diào)控CHB患者線粒體DNA甲基化[12]。PD-1是一種跨膜蛋白，存在于程序性死亡T細胞中，可誘導(dǎo)其在活化的CD4+和CD8+T細胞上表達。相關(guān)研究表明PD-1能抑制T細胞，誘導(dǎo)免疫耐受，PD-1與程序性死亡配體-1結(jié)合可增強T細胞線粒體的氧化反應(yīng)，提高活性氧和過氧化氫水平，抑制T細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，減弱機體對HBV的免疫應(yīng)答[13]。

本文研究結(jié)果顯示，各組血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示隨著疾病的持續(xù)進展，HBV感染者的血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平也會隨之發(fā)生變化。另外，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，疾病進展與HBV感染者血清DNMT1和PD-1水平均存在相關(guān)性(P<0.001)。分析原因在于：DNMT1是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族的成員，DNMT1表達上調(diào)使甲基化后宿主基因功能減弱，導(dǎo)致HBV感染加重[14]。PD-1/程序性死亡配體-1通路影響T細胞的增殖和分化，隨著PD-1水平的升高，機體的免疫力也隨之降低，有助于HBV復(fù)制，HBV感染加重，T細胞功能受限加重。長期HBV抗原刺激可誘導(dǎo)PD-1表達上調(diào)，通過與同時誘導(dǎo)程序性死亡配體-1高表達形成抑制性信號通路阻斷機體的強免疫反應(yīng)，導(dǎo)致病毒的活躍復(fù)制和疾病的持續(xù)性[15]。HBV感染疾病進展的不同階段，患者的機體免疫狀態(tài)存在差異性，PD-1的表達水平也不同。有研究發(fā)現(xiàn)，免疫耐受組和非活動攜帶組CD8+T細胞PD-1表達均高于免疫清除組(P<0.05)，提示PD-1表達水平可反映機體的免疫功能狀態(tài)[16]。HBV感染的免疫活化階段CD8+可以下調(diào)PD-1的表達，激活T細胞增殖，從而清除病毒；HBV還可通過此通路上調(diào)PD-1，抑制T細胞活化應(yīng)答，使病毒持續(xù)感染[17]。MADEDDU等[18]研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者DNMT1可調(diào)節(jié)線粒體DNA甲基化狀態(tài)，表明DNMT1參與乙型肝炎的發(fā)病過程。薛立芝等[19]研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎組血清DNMT1水平高于對照組，乙型肝炎e抗原(HBeAg)陽性組DNMT1水平高于HBeAg陰性組，CHB患者血清DNMT1水平與肝組織炎癥活動和肝纖維化存在緊密的關(guān)系，DNMT1可能參與CHB的發(fā)病過程，血清DNMT1水平可反映肝功能損傷、炎癥活動及肝纖維化程度等。上述研究與本研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，不同疾病進展期的HBV感染者血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平存在差異，且HBV感染者血清DNMT1和PD-1水平與疾病進展存在相關(guān)性。