TCT聯合Stathmin、p16INK4a對宮頸上皮內瘤變的診斷價值*

劉 琴，楊瑞娟，趙 航，李玉萍

陸軍第七十三集團軍醫院婦科，福建廈門 361000

宮頸癌是由宮頸上皮內瘤變(CIN)持續進展所致，而高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是CIN和宮頸癌主要致病因素[1-2]。機體從感染HPV至宮頸癌需經歷漫長的癌前病變期，在此階段實施有效干預，是減少宮頸癌發病的重要手段[3]。液基薄層細胞學檢查(TCT)有效提高了細胞學篩查的準確性，已廣泛用于宮頸癌前病變及宮頸癌診斷中，但單獨應用TCT易造成漏檢或出現假陰性、假陽性[4]。Stathmin具有癌蛋白功能，與多種惡性腫瘤進展及預后相關，且可用于CIN診斷及分級[5]。p16INK4a基因又稱多腫瘤抑制基因，有研究證明，肺癌、乳腺癌、食管癌等多種惡性腫瘤中存在p16INK4a基因缺失及p16INK4a蛋白低表達，而在CIN及宮頸癌中卻呈現相反的結果[6]。目前，Stathmin、p16INK4a參與CIN及宮頸癌的確切機制尚不清楚，且TCT聯合Stathmin、p16INK4a檢測在CIN診斷及低級別鱗狀上皮內病變(LSIL)與高級別鱗狀上皮內病變(HSIL)鑒別中的價值，臨床鮮有研究。基于此，本研究對此展開探討，以期為宮頸癌預防提供臨床依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年8月至2021年7月本院收治的142例CIN患者作為研究對象，將其中85例LSIL患者作為LSIL組，57例HSIL患者作為HSIL組，同期選取慢性宮頸炎[7]患者52例作為對照組。納入標準：LSIL組、HSIL組均經組織病理學檢查確診[8]。排除標準：切除全子宮者；有盆腔放化療史者；檢查前3 d內有陰道沖洗與用藥者；妊娠期或哺乳期女性；近期有激素使用史者；服用免疫抑制劑者；有嚴重肝、腎疾病史者。LSIL組年齡30～59歲，平均(44.39±6.83)歲；孕次1～5次，平均(1.83±0.41)次；性伴侶1個77例，>1個8例。HSIL組年齡30～58歲，平均(43.75±6.62)歲；孕次1～5次，平均(1.86±0.40)次；性伴侶1個52例，>1個5例。對照組年齡30～62歲，平均(44.51±7.26)歲；孕次1～6次，平均(1.80±0.39)次；性伴侶1個49例，>1個3例。3組年齡、孕次、性伴侶等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準[2019(年)倫審第(106)號]，所有患者對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2方法 (1)TCT檢測：避開月經期，將宮頸取樣毛刷插入子宮頸內，順時針旋轉3～5圈，取出毛刷，置于專用的脫落細胞保存瓶中。經ThinPrip2000系統程序化處理瓶中細胞，過濾、吸附，制成薄層涂片，蘇木素-伊紅(HE)染色，閱片，采用伯塞斯達系統分類法進行分類診斷，≥非典型鱗狀細胞記為陽性，<非典型鱗狀細胞記為陰性。(2)Stathmin、p16INK4a檢測：取宮頸活檢及錐切標本，固定，脫水，石蠟包埋，切片(4 μm)，HE染色，光鏡下觀察。LEICA BOND-MAX全自動免疫組化染色機(免疫組化法)檢測Stathmin、p16INK4a表達，用磷酸鹽緩沖液代替一抗做陰性對照染色。陽性標準[9]：細胞著色為無、<10%、10%～<50%、50%～70%、>70%分別記為0、1、2、3、4分，染色強度為不著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3分，以細胞著色與染色強度乘積>3分為陽性表達。

1.3觀察指標 (1)3組TCT及Stathmin、p16INK4a檢測結果。(2)TCT及Stathmin、p16INK4a檢測對CIN的診斷效能。(3)HSIL的影響因素。(6)TCT及Stathmin、p16INK4a檢測對LSIL、HSIL的鑒別價值。

1.4統計學處理 采用SPSS21.0統計軟件進行數據分析，計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Logistic回歸分析影響因素；采用受試者工作特征(ROC)曲線分析診斷價值，聯合預測實施Logistic二元回歸擬合，返回預測概率Logit(P)作為獨立檢驗變量。采用雙側檢驗，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.13組TCT及Stathmin、p16INK4a檢測結果 LSIL組、HSIL組TCT、Stathmin、p16INK4a陽性率高于對照組，且HSIL組TCT、Stathmin、p16INK4a陽性率高于LSIL組(P<0.05)。見表1。

表1 3組TCT及Stathmin、p16INK4a檢測結果[n(%)]

2.2TCT及Stathmin、p16INK4a檢測對CIN的診斷效能 TCT、Stathmin、p16INK4a單獨及聯合檢測診斷CIN的曲線下面積(AUC)分別為0.619、0.676、0.685、0.744，聯合檢測AUC高于單獨檢測。見表2、圖1。

表2 TCT及Stathmin、p16INK4a檢測對CIN的診斷效能

圖1 TCT及Stathmin、p16INK4a檢測診斷CIN的ROC曲線

2.3HSIL發生的單因素分析 單因素分析結果顯示，有癥狀(接觸性出血、外陰瘙癢、白帶增多等)、病灶多灶性及TCT、Stathmin、p16INK4a陽性均為HSIL發生的影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 HSIL發生的單因素分析

續表3 HSIL發生的單因素分析

2.4HSIL發生的多因素分析 以CIN情況為因變量，將表3中差異有統計學意義的項目作為自變量(賦值見表4)。Logistic回歸模型分析結果顯示，將癥狀、病灶多灶性控制后，TCT、Stathmin、p16INK4a陽性均為HSIL發生獨立危險因素(P<0.05)。見表5。

表4 賦值表

表5 HSIL發生的多因素分析

2.5TCT及Stathmin、p16INK4a檢測對LSIL、HSIL的鑒別價值 以HSIL者TCT及Stathmin、p16INK4a檢測結果作為陽性，以LSIL者TCT及Stathmin、p16INK4a檢測結果作為陰性，繪制各指標鑒別LSIL、HSIL的ROC曲線，結果顯示，TCT及Stathmin、p16INK4a聯合檢測鑒別LSIL、HSIL的AUC高于TCT、Stathmin、p16INK4a單獨檢測(P<0.05)；TCT、Stathmin、p16INK4a單獨檢測鑒別LSIL、HSIL的AUC對比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表6、圖2。

表6 TCT及Stathmin、p16INK4a檢測對LSIL、HSIL的鑒別價值

圖2 TCT及Stathmin、p16INK4a檢測鑒別LSIL、HSIL的ROC曲線

3 討 論

從HPV感染到宮頸癌需經歷CIN，即CIN 1級、CIN 2級、CIN 3級，CIN 1級歸為LSIL，多數LSIL可自然消退(80%以上)，CIN 2級、CIN 3級歸為HSIL，自然消退率僅20%～30%，具有較高惡性轉化風險[10]。因此，宮頸病變(尤其HSIL)是宮頸癌二級預防的重點。TCT是篩查宮頸癌前病變及宮頸癌的重要方法，但其以脫落細胞學形態改變為判斷依據，難免受閱片醫生主觀因素影響，準確性參差不齊，一直存在靈敏度低、漏診率高的缺陷，尤其在實驗室質量控制和對從業人員專業培訓不足的發展中國家[11-12]。本研究中，TCT診斷CIN的靈敏度為79.58%，特異度僅為46.15%，與既往研究相近[13]。

宮頸癌篩查正從細胞形態學逐漸轉向分子生物學，分子生物學改變通常早于細胞形態學改變[14]。p16INK4a基因由腫瘤抑制基因INK4a編碼，是首個被發現的直接參與抑制細胞分裂及細胞周期調控的抑癌基因[15]。有研究顯示，p16INK4a基因突變、缺失、甲基化等原因可引起p16INK4a蛋白失活，進一步導致細胞增殖失控，進而促進惡性腫瘤發生與進展[16-17]。有研究探討p16INK4a蛋白在CIN及宮頸癌中的表達情況發現，CIN及宮頸癌患者p16INK4a蛋白呈過表達現象[18]。本研究結果顯示，LSIL組、HSIL組p16INK4a陽性率高于對照組，且HSIL組p16INK4a陽性率高于LSIL組，與上述研究相似。分析相關機制：(1)p16INK4a蛋白過表達與高危HPV感染有關，HPV有2個主要致癌蛋白E6和E7，在高危HPV感染的宮頸組織中，E7結合視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)，解除pRb對p16INK4a蛋白的負反饋抑制，導致p16INK4a蛋白異常高表達，同時，E6和E7整合進入宿主細胞染色體內，分別引起p53、Rb蛋白功能失調，進一步導致p16INK4a蛋白反饋性過表達，使宮頸上皮細胞具有永生性的特點，誘發癌變[19]。(2)宮頸癌進展過程中，p16INK4a基因失活形式主要是甲基化，可能是p16INK4a蛋白過表達的原因之一[20]。(3)pRb功能缺失，Rb-E2F復合體合成減少，游離E2F增多，經反饋作用使CyclinD-CDK復合物增加，進而反饋性刺激p16INK4a蛋白表達升高[21]。本研究中ROC曲線分析顯示，p16INK4a診斷CIN的AUC為0.685，診斷效能較高。

Stathmin是一種微管相關蛋白(MAP)，相對分子質量為19 000，在細胞質中廣泛存在，可促進微管解聚，參與細胞周期及細胞生長調節，具有癌蛋白功能，在多種腫瘤中呈高表達[22]。本研究結果顯示，LSIL組、HSIL組Stathmin陽性率高于對照組，且HSIL組Stathmin陽性率高于LSIL組，提示Stathmin可能參與CIN發生及病情進展。有研究顯示，HPV持續感染與Stathmin高表達有關[23]。因此，推測HPV持續感染可誘導Stathmin表達，但具體機制仍需進一步分子生物學研究加以證實。ROC曲線分析顯示，Stathmin診斷CIN的AUC為0.676，具有一定診斷效能。TCT及Stathmin、p16INK4a檢測聯合診斷CIN的AUC為0.744，高于各項指標單獨檢測的AUC，因此，條件允許的情況下，可聯合TCT及Stathmin、p16INK4a檢測，為預測CIN診斷提供更有效的量化參考依據。

HSIL惡性轉化風險高，早期檢出可及時阻斷罹患宮頸癌的風險[24]。本研究Logistic回歸分析顯示，TCT、Stathmin、p16INK4a檢查陽性均為HSIL獨立危險因素，ROC曲線分析顯示，三者聯合鑒別LSIL、HSIL的AUC為0.803。根據上述分析，TCT、Stathmin、p16INK4a檢查陽性均可能與高危HPV持續感染有關，而高危HPV持續感染是CIN持續進展的重要因素，因此，在綜合評估病情時，考慮Stathmin、p16INK4a表達可為宮頸癌風險評估提供一定的意義和依據。

綜上所述，Stathmin、p16INK4a可作為宮頸上皮內瘤變篩查及分流的重要標志物，二者與TCT聯合檢測有助于CIN的診斷，并可區分LSIL和HSIL，為臨床治療提供參考。本研究的不足之處在于，盡管TCT及Stathmin、p16INK4a在CIN診斷及LSIL、HSIL鑒別中有一定價值，但AUC總體上偏低(<0.850)，這可能與選取病例有關，仍需后期繼續探討。