多肽復配組合物對皮膚結構相關效應蛋白促進表達協同增效的研究

皮膚中存在眾多的ECM（extracellular matrix，細胞外基質）蛋白，其中膠原蛋白、彈性蛋白是最重要的兩種

，它們在皮膚抗衰老中起著非常重要的作用。除了膠原蛋白和彈性蛋白，還有非常多的結構蛋白，結構輔助蛋白

。在這些結構輔助蛋白里，LOXL-1是一種很重要的細胞外依賴銅的胺氧化酶

，催化膠原蛋白和彈性蛋白中交叉鏈接形成的第一步，其表達量的增加能更好地促進膠原蛋白和彈性蛋白纖維的生成

。

彈性蛋白是彈性纖維(elastic fbers)的主要成分。彈性纖維主要存在于韌帶和脈管壁。彈性纖維與膠原纖維共同存在， 賦予組織以彈性和抗張能力。盡管彈性蛋白只占真皮總蛋白的2%，但它對皮膚彈性起著重要作用

。

乙酰基二肽-1鯨蠟酯，乙酰基四肽-2，假交替單胞菌發酵產物提取物都是各大化妝品公司經常使用的核心原料，原料供應商提供的之前的研究資料表明，乙酰基二肽-1鯨蠟酯能有效促進彈力蛋白的再生，注重彈性纖維的修復，為肌膚打造一層健康、緊致的纖維網絡，抑制表情紋。它同時被稱作肌膚的“彈力素”，可支撐松垮的皮膚，提供緊致上揚的彈力。乙酰基四肽-2可以上調與膠原蛋白合成和黏著斑有關的基因表達，誘導彈性蛋白、I型膠原蛋白合成，從而增加皮膚緊實度。假交替單胞菌發酵產物提取物具有促進成纖維細胞增殖，誘導I型，IV型膠原蛋白和彈性蛋白合成，提高皮膚屏障功能，減少炎性基因表達，抑制脂質過氧化等諸多功效，然而對這三者進行的單獨和聯合的功效比較測試還未有研究，此次研究就評估了三個原料的聯合對皮膚相關結構蛋白的協同增效促進作用。

材料和方法

01 試劑與儀器

DMEM 培養基（20210121/20210406，Cellmax），血清（2132094P，Gibco），胰酶（20210113/20210323，碧云天），雙抗（20200828，北京索萊寶科技有限公司），TRIzon（03877/35120，康為世紀），三氯甲烷（20200105，國藥化學試劑），HiFiScript cDNA Synthesis Kit（100rxns34520，康為世紀），UltraSYBR（31420，康為世紀）, 噻唑藍（MTT，Sigma-Aldrich 公司， M2128-100MG），HFF-1人皮膚成纖維樣細胞（中國科學院典型培養物保藏委員會上海細胞庫, 培養條件：5% CO

，37℃恒溫培養箱,培養基：89% DMEM+10%FBS+1%雙抗）， 乙酰基二肽-1鯨蠟酯（1453629，Sederma），乙酰基四肽-2 （U19B013-20，Lipotec），假交替單胞菌發酵產物提取物（U07K010-19，Lipotec），生物顯微鏡（LWD300-38LT，上海測維光電技術有限公司），恒溫水浴鍋（HH-1嘉興俊思電子有限公司），高速冷凍離心機（Sorvall Legend Micro 17R，Thermo），CO

培養箱（BB150，Thermo），純水儀（Smart-DUF，上海和泰儀器有限公司），多功能酶標儀（SpectraMax iD3，Molecular Devices）。

02 測試方法

取指數生長期的細胞制成單細胞懸液，以1×104 cells/mL的密度接種于96孔板上，用含10%胎牛血清的培養基37℃培養24 h使細胞貼壁，培養終體積為0.2mL，而后吸棄上清，加入新鮮制備的不同濃度的藥物（無血清）或者不加藥物（無血清）孵育，培養終體積為0.2 mL。24 h后，顯微鏡下觀察細胞毒性情況。MTT法檢測細胞毒性，于490 nm測定吸光度，計算細胞活率。細胞活率 =A

/A

×100%。

取指數生長期的細胞制成單細胞懸液，以1×105 cells/mL的密度接種于6孔板上，用含10%胎牛血清的培養基37℃培養24 h使細胞貼壁，培養終體積為2 mL。而后吸棄上清，加入新鮮制備的不同濃度的藥物（無血清）或者不加藥物（無血清）孵育，培養終體積為2 mL。24 h后，按RNA提取標準操作流程提取各孔RNA，qPCR法檢 測HFF-1細 胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、Col-XVII、Elastin、Fibrillin-1 、Fibulin-5、Decorin、LOXL-1 、TGF-β、Integrin mRNA的表達影響。

行動主張：建議學院專業再次結合現專業、行業背景確定什么是基本能力，什么是必要的擴展能力，當下行業緊俏的擴展能力，但不能設置的太高，不然達不到技訓的目的。

本研究選取5 μg/mL乙酰基二肽-1鯨蠟酯、5 μg/mL乙酰基四肽-2、5 μg/mL假交替單胞菌發酵產物提取物單獨或聯合對HFF-1細胞孵育24 h，提取細胞總RNA后，qPCR檢測膠原蛋白相關mRNA的表達，結果如圖2所示。5 μg/mL乙酰基二肽-1鯨蠟酯、5 μg/mL乙酰基四肽-2、5 μg/mL假交替單胞菌發酵產物提取物單獨給藥能促進COL-I， COL-III，COL-IV, LOXL-1的表達，與單獨給藥相比，5 μg/mL 乙酰基二肽-1鯨蠟酯、5 μg/mL乙酰基四肽-2、5 μg/mL假交替單胞菌發酵產物提取物聯合給藥，協同增加HFF-1細胞Col-I、LOXL-1mRNA的表達（

＜0.05）。

受試物和對照品用DMSO或者ddH2O配制成母液，再用無血清培養基或者PBS稀釋至合適濃度。

本題是培養學生轉化能力的極佳素材，雖然條件一讀就懂、圖形一看就明，但一做卻又難以入手．不過，借助“知識溯源式目標分析法”卻可巧妙地讓解題思維轉化路線圖水落石出．

分別用0.1、0.5、1、5、10、20、40 μg/mL 乙酰基二肽-1鯨蠟酯，乙酰基四肽-2，假交替單胞菌發酵產物提取物，或乙酰基二肽-1鯨蠟酯：乙酰基四肽-2：假交替單胞菌發酵產物提取物質量比為1：1：1聯合給藥，MTT法評估細胞毒性，結果如圖1所示，由圖1可知，乙酰基二肽-1鯨蠟酯在20ug/mL下都沒有細胞毒性，乙酰基四肽-2在40ug/mL都沒有毒性，假交替單胞菌發酵產物提取物在40ug/mL下都沒有細胞毒性，乙酰基二肽-1鯨蠟酯，乙酰基四肽-2，假交替單胞菌發酵產物提取物三者1：1：1聯合給藥，在20ug/mL下非但沒有細胞毒性，而且還能促進細胞增殖。

虛擬云桌面就是對計算機桌面進行虛擬化，它是通過在數據中心服務器上創建虛擬桌面為載體，然后運用一系列網絡傳輸協議將遠端的操作系統和應用發送給多媒體教室終端設備的過程。南京城市職業學院多媒體教學場景所采用的虛擬桌面是通過VMware vSphere構建虛擬化平臺+瘦客戶機的方式實現的。通過虛擬化技術的運用，使整個部署過程變得十分簡便，也讓遠程統一管控變為現實。

結果

01 受試物對HFF-1細胞毒性的影響

細胞給藥后提取總RNA，qPCR，檢測HFF-1細胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、Col-XVII、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、Decorin、LOXL-1、TGF-β、IntegrinmRNA的表達影響。

乙酰基二肽-1鯨蠟酯， 乙酰基四肽-2，假交替單胞菌發酵產物提取物單獨或聯合給藥24 h對HFF-1細胞增殖的影響。

= 3, Mean ± SEM。“ ＊＊＊ ”表示與對照組相比

＜ 0.001。

02 受試物對HFF-1細胞膠原蛋白相關基因表達的影響

近幾天來，楊力生做生意特別賺錢，他心里高興，想起了老婆一些好處，便想和老婆親熱一番。晚上九點以后，孩子到西間睡去了。楊力生湊到老婆身邊，討好地說：“怎么樣，今天很累嗎？”

采用Excel錄入和 GraphPad Prism 7 軟件包統計處理，以均數±標準誤表示。各組間做單因素方差分析（ANOVA）。認為

＜0.05有統計學差異。

乙酰基二肽-1鯨蠟酯、乙酰基四肽-2、假交替單胞菌發酵產物提取物單獨或聯合給藥24 h對HFF-1細胞膠原蛋白相關基因mRNA表達的影響。

= 3, Mean ± SEM。“＊”表示與聯合給藥組相比

＜ 0.05， “ ＊＊ ”表示與聯合給藥組相比

＜ 0.01， “ ＊＊＊ ”表示與聯合給藥組相比

＜ 0.001。

給予康復訓練，首先是采用冷刺激閥，刺激患者的口腔、咽喉部，如采用冷凍棉簽按摩口唇、咽頰部與咽腭弓，幫助患者練習吞咽動作，提高其舌體的力量及靈活度等；其次幫助患者進行屏氣、發聲運動，指導其在坐椅上，并用雙手支撐、推壓，同時做屏氣動作，注意應保持胸廓的固定，聲門也應緊閉，再突然松手、開聲門、呼發聲；最后訓練其自行攝食，應選擇30～60°頸前屈、仰臥位進食[3] 。以上訓練方法時間為30 min，1次/d。訓練時間為2周。

03 受試物對HFF-1細胞彈性蛋白相關基因表達的影響

5 μg/mL乙酰基二肽-1鯨蠟酯、5 μg/mL乙酰基四肽-2、5 μg/mL假交替單胞菌發酵產物提取物單獨或1：1：1聯合對HFF-1細胞孵育24 h，提取細胞總RNA后，qPCR檢測彈性蛋白相關mRNA的表達，結果如圖3所示。5 μg/mL乙酰基二肽-1鯨蠟酯、5 μg/mL乙酰基四肽-2、5 μg/mL假交替單胞菌發酵產物提取物單獨給藥能促進Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-β、Integrin 的mRNA表達，與單獨給藥相比，5 μg/mL 乙酰基二肽-1鯨蠟酯、5 μg/mL乙酰基四肽-2、5 μg/mL 假交替單胞菌發酵產物提取物聯合給藥協同增加HFF-1細胞Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-βmRNA 的表達（

＜0.05）。

乙酰基二肽-1鯨蠟酯，乙酰基四肽-2，假交替單胞菌發酵產物提取物單獨或聯合處理24 h對HFF-1細胞相關mRNA表達的影響。

= 3, Mean ± SEM。“＊”表示與聯合給藥組相比

＜ 0.05，“ ＊＊ ”表示與聯合給藥組相比

＜ 0.01， “ ＊＊＊ ”表示與聯合給藥組相比

＜ 0.001。

軟土路基處理技術在我國公路工程建設中發揮了重要作用。公路軟土路基處理技術發展歷史較長，經多年的發展積累了豐富的經驗。路基處理技術的發展可分為兩個時期，建國初期應用路基處理技術主要為擠密土樁，砂石墊層等。80年代后期，隨著改革開放的發展，建筑工程建設不斷進步。在公路工程建設中引進了大量的國外先進技術，促進了我國建筑事業建設發展。

小結與討論

化妝品中的生物多肽類化合物具有高生物活性、易吸收、安全無毒的獨特優勢。近年來其在美容護膚、抗衰老研究課題中的生理作用與生物效應逐漸引發關注

；多肽的生物學活性取決于其氨基酸組成和序列，人體內各種生理進程幾乎都是由特定的氨基酸序列組成的多肽或者蛋白質調控的。因此，生物活性肽為化妝品研發和應用提供了全新方向和思路，并且功能越來越細分，如抗衰老、抗過敏、修復、抗氧化、抗水腫、促進毛發再生、抑制黑色素生成等。添加多肽到化妝品中能夠幫助改善、修復皮膚的各種問題，但目前單種多肽活性物質應用報道較多，而多種多肽和活性物的組合應用研究開發較少

，特別是多種不同類型的肽類和活性物組合針對抗衰老的靶點協同增效作用報道較少。本研究中的多肽提取物組合協同增效結果，在活性物組合的研究中，具備較強的創新性。在本研究中，我們采用乙酰基二肽-1鯨蠟酯、乙酰基四肽-2、假交替單胞菌發酵產物提取物聯合給藥，發現協同給藥能協同促進HFF-1細 胞Col-I、LOXL-1、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5 mRNA的表達，獲得更強、更顯著的抗衰老效果。

本罪為情節犯，由法條可以看出，分為情節嚴重和情節特別嚴重，相對應的有兩種輕重不同的法定刑。至于何謂“情節嚴重”或“情節特別嚴重”，并沒有明確規定。一般認為，多次、大量非法獲取他人計算機數據的為情節嚴重。

綜上所述，本研究采用乙酰基二肽-1鯨蠟酯、乙酰基四肽-2和假交替單胞菌發酵產物提取物三種活性組份，針對抗衰老的靶點進行協同增效作用，能夠顯著地增加對抗衰老相關的重要蛋白的表達。因而，本研究中的抗衰老組合物、乙酰基二肽-1鯨蠟酯、乙酰基四肽-2、假交替單胞菌發酵產物的聯合應用，具有更好的協同增效的抗衰老活性，因為聯合作用功效增強了，在同等的功效下，聯合作用原料可以用量更小，所以這樣的組合具備在化妝品產品中少量添加就能達到更好效果的應用前景。

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